乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中hbx、 mhbst mrna的表达及其意义

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1、乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBx、MHBstmRNA的表达及其意义作者：于艳,张静*,王汉民,陈威,洪柳,刘彦仿刘宏宝【摘要】目的:检测乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBVGN）肾组织中乙型肝炎病毒X基因（HBx）及截短型乙型肝炎病毒表面抗原（MHBst）mRNA的表达,探讨HBx、MHBst在HBVGN发生中的意义。方法:采用原位杂交的方法对40例HBVGN患者的肾组织进行HBx、MHBstmRNA检测。结果:HBVGN患者肾组织中存在HBx、MHBstmRNA,HBx、MHBstmRNA主要分布于肾小管上皮细胞的胞质内,少数肾小球上皮、内皮、

2、系膜细胞的胞质内也有分布;肾小管上皮细胞内HBx、MHBstmRNA阳性率分别为82.5％（33/40）、80％（32/40）,肾小球内HBx、MHBstmRNA阳性率分别为30％（12/40）、22.5％（9/40）,HBx、MHBstmRNA在肾小管上皮细胞的表达明显高于肾小球（P＜0.01）。结论:在HBVGN肾组织,特别是在肾小管上皮细胞的胞质存在HBx、MHBstmRNA的表达,提示HBV感染及其基因整合可能在HBVGN发生中有一定意义。【关键词】乙型肝炎病毒相关性肾炎;HBx;截短型乙型肝炎病毒表面抗原;原位杂交9乙型肝炎病毒（he

3、patitisBvirus,HBV）感染在我国高发,由其所引发的乙型肝炎病毒相关性肾炎（hepatitisBvirusassociatednephritis,HBVGN）较常见［1］,但目前有关HBVGN的发病机制尚不十分清楚。既往研究发现肾小球内存在HBV的完整病毒颗粒（Dane颗粒）或类似病毒的颗粒［2］;在肾小球内及肾皮质中检测出游离和整合的HBVDNA和mRNA,提示HBV在HBVGN肾组织（以肾小管上皮细胞为主）内存在复制［3］,对肾组织可能具有直接作用,但在此方面尚未见到深入研究的报道。在肝脏研究中,发现第194～76个氨基酸之间截

4、短的乙型肝炎病毒表面抗原（Cterminallytruncatedmiddlesizesurfaceproteins,MHBst）和全长的X蛋白（hepatitisBvirusXprotein,HBx）基因编码的蛋白均具有反式激活作用,能够激活某些核转录因子,使其发生核转位,导致炎症的发生［4］。为此,我们运用原位杂交方法,对40例HBVGN患者的肾组织石蜡标本中HBx、MHBstmRNA的表达进行检测,观察HBV在肾组织中的存在及复制情况,以期探讨HBV在HBVGN发病机制中的作用,为临床HBVGN的诊断和治疗提供依据。1材料和方法1.1材

5、料HBVGN石蜡标本(40例)收集自1999-01/2005-10西京医院院收治的住院患者40（男34,女6)例,年龄14～68岁,病程20d～10年,所有病例均经HBV血清学检测证实存在HBV感染,9并在B超引导下经皮肾穿刺活检术,肾组织分别进行组织学、免疫组化染色/免疫荧光及超微病理检查,病理类型证实均为不典型的膜性肾病,符合我国1990年制订的乙肝相关性肾炎的诊断标准［5］。设置2例血清HBsAg阳性的慢性活动性乙型肝炎患者肝组织为阳性对照;阴性对照8例,5例为原发性膜性肾病,3例为肾小球轻微病变,均经常规肾活检及电镜诊断证实,并结合HB

6、V血清学及肾组织内免疫组织化学检测HBVAg等检查排除HBV感染及其他继发性膜性肾病。TaqDNA聚合酶购自Promega公司;DNA回收试剂盒购自优晶生物工程公司;检测试剂盒购自Roche公司。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据adr亚型HBVcDNA基因序列［gi:32250975］设计HBx、MHBstDNA探针的PCR引物,引物由上海生工生物工程公司合成。1.2.2PCR反应及产物纯化10×Buffer5μL、10mmol/LdNTP4μL,模板DNA3μL（除MHBst2为1L）,特异引物各1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,

7、加ddH2O至50μL,反应参数为94℃预变性5min,然后94℃变性30s,54℃复性30s（除MHBst2为52℃）,72℃延伸40s,循环30次（MHBst1、2为35次）,72℃再延伸7min。PCR产物琼脂糖电泳,DNA回收试剂盒回收、纯化DNA片段。91.2.3地高辛标记HBx、MHBstDNA探针采用DNA随机引物法进行标记,具体方法按地高辛DNA随机引物标记和检测试剂盒说明进行。探针标记好后储存在TEbuffer(10mmol/LTrisHCl,1mmol/LEDTA,pH7.4)中,2个月内进行实验。1.2.4HBVGN肾组

8、织切片的原位杂交前处理新鲜载玻片和盖玻片冲洗、泡酸、高温烘烤,以灭活RNAase,冷却后涂以APES避免组织脱片。在DEPC水处理下进行切片,石蜡切片