bmp2和fgf2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

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1、BMP2和FGF2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响作者：张为西,陈松林,姚晓黎,卢锡林,周琛,冷雁,XingmingShi【摘要】目的:观察骨形成蛋白（BMP2）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的影响。方法:取3~18月雄性C57BL/6J小鼠（共50只）的骨髓细胞,分离贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,并鉴定为MSCs后,再进行贴壁培养24h后,分别在成骨细胞诱导培养液中加入100μg/LBMP2和0.5nmol/LFGF2持续诱导7、14、21d后,进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测,Vonkossa染色以及

2、茜素红染色,并用递转录荧光定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因(Runx2/cbfa1、Alp、collagen1、osteocalcin)的表达情况。结果:BMP2刺激组的ALP活性以及钙化结节明显高于对照组,Runx2/cbfa1,ALP,collage1,osteocalcin的mRNA呈高表达;FGF2刺激组的ALP活性以及钙化结节也高于对照组,Runx2/cbfa1、Alp、collagen1、osteocalcin的mRNA表达量也高于对照组,但不如BMP2明显。结论:BMP2和FGF2在不同程度上促进体外培养的小鼠MSCs向成骨细胞方向分化。11【

3、关键词】小鼠;骨髓间质干细胞;BMP2;FGF2骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,MSCs）具有自我更新和多向分化的潜能,可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞甚至神经细胞分化,已成为骨组织工程的理想种子细胞。骨形成蛋白（bonemorphogeneticproteins,BMP）属于TGFβ超家族成员,是骨组织工程中应用最广泛的信号蛋白,其中BMP2是最重要的成骨形成调控因子。而碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,FGF2,bFGF）也是软骨、骨生长和分化的一种主要调控因子,在骨

4、的生长和发育中起到一定的作用。然而,在对大鼠、小鼠、兔、人等骨髓基质细胞、间质干细胞向成骨细胞分化的研究中,BMP2和FGF2所起的作用,结果不甚一致［1-4］。我们用外源性BMP2和FGF2刺激小鼠来源,经纯化和鉴定后的MSCs,观察BMP2和FGF2对MSCs向成骨细胞方向分化的影响。1材料和方法1.1材料C57BL/6J小鼠50只(每次实验使用5只,体质量18~26g),购于美国Jackson实验室。每只笼饲养3~5只,标准啮齿类动物饮食,动物的处理和饲养均遵循美国NIH指南。倒置相差显微镜（Axiovert35,Zeiss,Germany）;多功能分光光度计（VI

5、CTOR3TMV,PerkinElmer）;扫描仪（Cannon,USAInc）;荧光定量PCR仪（MJ11Research）;OneStepTMNBT/BCIP溶液（Pierce,Rockford,IL）;TRIzol试剂（Inritrogen公司）;Taqman逆转录酶试剂盒和SYBRGreenMasterMix（AppliedBiosystems）;BMP2(PEPROTECH公司);FGF2(RD公司);硝酸银溶液（Fluka）;其余所有化学试剂均购于美国SigmaAldrich公司。1.2方法1.2.1小鼠MSCs的体外分离、扩增、纯化和鉴定按参考文献［6］的方法进

6、行。1.2.2MSCs的成骨细胞诱导培养取体外培养扩增的第4代MSCs,以1×104/cm2的MSCs细胞密度种植在96孔板上培养,共分3组,每组3个培养孔,OS对照组:培养第2天加入成骨细胞诱导培养液（osteogenicmedia,OS）诱导（DMEM,20mL/L胎牛血清,5mmol/Lβ甘油磷酸,50μmol/L抗坏血酸）,OS+BMP2诱导组:在OS基础上再加入100μg/LBMP2。OS+FGF2诱导组:在OS基础上再加入0.5nmol/LFGF2,持续诱导,隔日换液。7d后,进行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定。14d或21d后对于钙沉积用vonkos

7、sa染色或/和茜素红（AlizarinRedS,ARS）染色鉴定。同时,以同样密度的相同的MSCs接种在6孔培养板上培养,按上述方法分组,诱导7d后,收集细胞,提取RNA,作逆转录荧光定量PCR11检测Runx2/cbfa1,ALP,collagen1,osteocalcin的表达量。1.2.3ALP染色用无磷酸钙的PBS冲洗细胞3次后,40g/L多聚甲醛室温固定30min,双蒸水冲洗3次后,用OneStepTMNBT/BCIP溶液(PIERCE)染色