不含氨基末端的pif1解螺旋酶的纯化和初步功能研究

《不含氨基末端的pif1解螺旋酶的纯化和初步功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究【摘要】　　目的从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能，纯化只含有解螺旋酶模序，不含N末端的PIF1蛋白——PIF1△N，并对其生物化学活性进行检测。方法以Hela细胞的cDNA文库为模版，PCR扩增得到PIF1的540～1923的cDNA序列，在cDNA的5′端引入六聚组氨酸标签后插入pET20b表达载体，得到重组质粒pET20PIF1△N。通过共转化此重组质粒和一个编码稀有rRNA的质粒，PIF1△N蛋白在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过一系列亲和层析柱，用高效液相纯化系统

2、纯化了PIF1△N蛋白，并检测其生物化学活性。结果从Hela细胞的cDNA文库中克隆了PIF1蛋白的540～1923的基因片段，使其在大肠杆菌中成功表达。建立了纯化PIF1△N蛋白的亲和层析方法，并检测了其ATP酶活性。结论不含N末端的PIF1蛋白-PIF1△N，具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性。【关键词】PIF1解螺旋酶蛋白纯化ATP酶　　ABSTRACT:ObjectiveToelucidatephysiologicalfunctionsofhumanPIF1helicaseatthemolecularlevel,purif

3、yNterminaltruncatedPIF1helicase,PIF1△N,andassayitsbiochemicalproperties.MethodsTheNterminalcDNAsequenceofPIF1helicasewasamplifiedbyPCRusingtheHelacellcDNA11libraryastemplate.ThecDNAwithahistidinetagattheNterminuswasinsertedintothepET20bvectortoproducerecombinantplasm

4、id.TherecombinantPIF1△NwassuccessfullyexpressedbycotransformingaplasmidencodingrarerRNA.At4℃throughaseriesofaffinitycolumntherecombinantPIF1△Nproteinwaspurifiedbyfastproteinliquidchromatograph.ThebiochemicalactivityofPIF1△Nwasassayed.ResultsThecDNAfragmentofhumanPIF1fr

5、om540～1923wasclonedfromHelacDNAlibrary,andtherecombinantPIF1△NproteinwassuccessfullyoverexpressedinE.coli.ThepurificationprocedureofPIF1△Nproteinwasestablishedanditsbiochemicalactivitywasidentified.ConclusionNterminaltruncatedPIF1helicase,PIF1△N,hasATPaseactivity,which

6、isDNAandMg2+dependent.　　KEYWORDS:PIF1helicase;DNApurification;ATPase　　解螺旋酶能利用NTP水解释放的能量催化两条互补的DNA双链解开成单链，在几乎所有的核酸代谢中都有重要作用[1]。解螺旋酶的一个特点是其氨基酸序列中存在几个进化上非常保守的氨基酸模序(motif)，叫做解螺旋酶模序。解螺旋酶根据解螺旋酶模序被分成超级家族(superfamily)，绝大多数属于超级家族Ⅰ和Ⅱ[2]。11　　PIF1解螺旋酶家族属于超级家族Ⅰ，有很多重要的生理功能。线粒体PIF1蛋白参

7、与线粒体DNA的重组及稳定[3]，参与碱基切除修复以拮抗DNA自发的氧化损伤[45]，参于双链DNA断裂的修复从而增加细胞对溴化乙锭引起损伤的抗性[6]。细胞核PIF1蛋白能抑制端粒酶活性，参与DNA修复、参与冈崎片段的成熟及维持基因组的稳定[79]。由于PIF1解螺旋酶家族蛋白水溶性低、易于凝集，使得PIF1蛋白的纯化非常困难。目前为止，对PIF1蛋白的研究主要来自遗传学数据，生物化学的研究数据非常有限。　　有关人类PIF1蛋白的功能目前尚不清楚。为了从分子水平阐明人类PIF1解螺旋酶的生理功能，我们克隆并纯化了不含N末端，但含

8、有7个解螺旋酶模序的人类PIF1蛋白—PIF1△N，并且证明了PIF1△N具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性。　　1材料与方法　　1.1所用菌株与质粒　　构建PIF1△N表达重组体的质粒为pET20b(Novagen)