sfgfr1基因的克隆与在rts系统中的高效表达

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1、sFGFR1基因的克隆与在RTS系统中的高效表达作者：陈勇，崔大祥，孙凯，杨雁灵，戴辉【关键词】成纤维细胞生长因子　　【Abstract】AIM：ToclonesFGFR1geneandexpresscorrespondingproteininRTS.METHODS:Swissrat3T3fibroblastswerecultured,totalRNAswereextractedandsFGFR1cDNAwasobtainedbyRTPCR.ThefragmentswerecutbymeansofNcoIandSmaIandproductswereclonedintopI

2、VEX23dvectorandsequenced.SFGFR1proteinwasexpressedbyusingRTSProteinMaster500andproductswereanalyzedbyWesternBlot.RESULTS:sFGFR1genewasclonedandsequencinganalysisconfirmedtheclonedsequencewascorrect.WesternBlotresultsconfirmedsFGFR1washighlyexpressed.CONCLUSION:sFGFR1geneisclonedandhighlye

3、xpressedinRTS.　　【Keywords】receptors,fibroblastgrowthfactor;cloning,molecular;rapidtranslationsystem;geneexpression　　【摘要】目的：克隆sFGFR1(solublefibroblastgrowthfactorsreceptor1)基因，并在RTS(rapidtranslationsystem)系统中高效表达相应蛋白.方法：培养Swissrat3T3fibroblast7细胞株，提取总RNA，用RTPCR方法获取鼠sFGFR1cDNA片段,酶切后克隆到pIVEX

4、2.3d载体并进行序列分析；采用RocheRTSProteinMaster500系统，高效表达sFGFR1蛋白并用WesternBlot鉴定表达的蛋白.结果：克隆了sFGFR1基因，测序证实序列正确；WesternBlot证实sFGFR1蛋白在RTS系统中高效表达.结论：克隆了sFGFR1基因并在RTS系统获得高效表达.　　【关键词】受体，成纤维细胞生长因子；克隆，分子；RTS；基因表达　　0引言　　器官移植的预后与机体免疫排斥反应程度密切相关.目前研究表明，FGF1与FGF2在出现慢性排斥反应的移植肾脏、心脏或皮肤等组织中呈强烈地高表达，与移植物因慢性排斥所造成的移植器

5、官内血管进行型硬化AGA（acceleratedgraftarteriosclerosis,AGA）的产生成正相关［1-3］.目前对慢性排斥反应尚无有效治疗手段.采用转基因技术，高效表达可溶性成纤维细胞生长因子受体sFGFR1蛋白，有可能阻断FGF对血管内膜增生的刺激作用，从而抑制AGA形成.我们研究克隆并高效表达了sFGFR1（solublefibroblastgrowthfactorreceptor1,sFGFR1），为进一步研究sFGFR1在抑制慢性排斥反应中的作用奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料鼠3T3细胞株本室保存.pIVEX2.3d载体，RTS500E

6、.ColiHYKit与RTSProteinMaster500设备及配套试剂购自Roche7LifeScience公司.NcoI与SmaI酶购自EnglandBiolab公司.FGFR1抗体购自CambridgeAntibody公司.其他试剂购自GermanyMerck公司.PCR引物由崔大祥博士设计，由MWGLifeScienceCompany合成.上游引物：5′GTCCCATGGTGGGATGTGGGGCTGGAGG3′,下游引物：5′GCGCCCCGGGTATTCCAGGTACAGASGGTGAGGT3′,含有NcoI与SmaI酶切位点.　　1.2方法　　1.2.1细

7、胞培养、总RNA的提取与RTPCR反应常规培养鼠3T3细胞株，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA，用无RNA酶的DNA酶除去可能残余的DNA，用下游引物作起始引物，进行反转录，条件为：10×ReverseTranscriptionBuffer2mL,10mmol・L-1dNTPs2mL,RNasininhibitor05mL,MgCl24mL,Primer21mL,TotalRNA6mL,FreeRNasewater4mL,AMVReverseTranscriptase1mL,Totalvolume20mL.室温