基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞rna干扰转染条件研究

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1、基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究作者：王静，李茹柳，郭文峰，徐颂芬，羊燕群，高小玲，陈蔚文【摘要】【目的】探索影响大鼠小肠上皮细胞(IEC6)RNA干扰效率的转染条件，为进一步以RNA干扰(RNAi)技术构建不同程度表达靶蛋白的细胞模型打下基础。【方法】以24孔培养板培养IEC6细胞，利用阳离子脂质体转染FAMsiRNA片段进入IEC6细胞，采用荧光显微镜和流式细胞仪检测FAMsiRNA和转染试剂Lipofectamine2000不同剂量比例对转染效率的影响。【结果】(1)采用荧光显微镜检测转染效率，以评分进行秩

2、和检验，结果仅有转染试剂或仅有FAMsiRNA或两者均无的组别评分均为0，转染试剂加FAMsiRNA组别均有或强或弱的荧光表达。(2)采用流式细胞仪检测转染效率，以Lipofectamine200010μL+FAMsiRNA160nmol/L组转染效率最高(平均763%)，而空白对照组约为1%。【结论】FAMsiRNA160nmol/L(20μmol/L、48μL，终体积为06mL)+Lipofectamine200010μL组合为IEC6细胞RNA干扰时转染效率最高的转染条件。【关键词】基因功能;RNA干扰;细胞培养13RNA干扰

3、(RNAinterference，RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)启动序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。Fire等[1]首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力[2-3]。目前RNA干扰技术在国内外已成为研究基因功能最常用的技术之一。　　影响RNA干扰

4、效率的主要因素是小型干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)的序列及转染效率，而控制不同的干扰效率可建立模拟靶蛋白不同表达水平的细胞模型。因此，对转染条件的控制有利于获得对目的蛋白表达不同干扰程度的细胞模型。而影响转染效率的关键是转染试剂和siRNA的比例，但不同种类的细胞该比例是不同的。小肠上皮细胞6(IEC6)细胞株是Quaroni等[4]研究建立的，其来源于新生的正常大鼠小肠，在组织学和免疫学方面具有隐窝样上皮细胞的特征，为未分化的上皮干细胞，无特异性基因表达及无致瘤性。目前将RNAi技术应用到肠上皮细胞的研究国内较少

5、报道。本实验室近年来以IEC6细胞株用于消化系统疾病的体外相关研究[5-7]。为在该细胞上开展RNAi的脾气虚证相关基因的功能研究，本实验采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率的方法，优化阳离子脂质体转染siRNA进入IEC136细胞的条件，为后续实验提供参考。现报道如下。　　1材料与方法　　11细胞株IEC6细胞株(CRL1592)购自TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)，LOT：4785615。　　12主要试剂与仪器Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)、Fetal

6、BovineSerum(FBS)均为GIBCO公司产品，胰酶Trypsin(1∶250)为Amresco产品，乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na·2H2O，分子量37224)由广州威佳科技有限公司提供，Albumin及Bovine为Genebase产品，牛胰岛素(insulin)为Sigma产品，Ncontrol05815FAM(No.2005815122174)购自广州市瑞博生物科技有限公司，转染试剂LipofectamineTM2000(Cat.No.11668027)、OptiMEM(Cat.No.31985062)均由Invitrog

7、en公司提供。IX71型相差荧光倒置显微镜为Olypums公司产品，ALTRAEPICS型流式细胞仪为贝克曼尔特实验系统(苏州)有限公司广州分公司产品。　　13细胞培养取液氮保存的IEC6细胞37℃水浴使其迅速融化后，将冻存液转移至离心管内，3000r/min离心5min，去上清液，加入2mLDMEM完全培养液(体积分数90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+4mmol/LL谷氨酰氨+01U/mL牛胰岛素+10mmol/L13HEPES)重新悬浮沉淀的细胞，接种于培养瓶，体积分数10%CO2、90%空气，饱和湿度下37°C培养，次日换液。至8

8、0%左右融合时，用25g/L胰酶053mmol/LEDTA消化传代。　　14种植细胞待