人结肠癌sw480裸鼠肝转移模型的建立

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1、人结肠癌SW480裸鼠肝转移模型的建立作者：牛洪欣　何庆泗　冷永德　刘英姿【关键词】结直肠肿瘤肝肿瘤肿瘤转移小鼠裸　　肝脏是结直肠癌最常见的靶向转移部位，肝转移成为结直肠癌患者死亡的最主要因素［1］，虽已有大肠癌早期肝转移的预测研究报告［２］，但以人结直肠癌细胞在裸鼠体内建立肝转移模型，已成为研究结直肠癌肝转移机制和抗转移治疗的主要实验方法。本研究模拟结直肠癌切除术后癌细胞回流入门静脉至肝脏血道播散而发生肝转移的过程，采用脾脏种植法建立SW480裸鼠肝转移模型。1材料与方法1.1　实验动物和细胞株　4～6周龄BALB/C裸鼠24只，雌性，体质量12～18g，购自山

2、东大学实验动物中心，饲养于SPF环境下。人结肠癌细胞株SW480，购自第四军医大学。1.2　结肠癌肝转移动物模型的建立71.2.1　收集制备细胞悬液　人结肠癌SW480细胞培养于RPMI1640含新生牛血清（体积分数10%）的培养液中，置于37℃、含5%CO2的培养箱内恒温孵育传代，获得足够细胞数量后，选择生长状态良好，约80%汇合的细胞进行收集，制成5×107ml-1的细胞悬液，冰浴至脾内接种。1.2.2　脾内种植（保留脾脏）法建立结肠癌肝转移动物模型　裸鼠称重，用1%戊巴比妥钠45mg/kg腹腔内注射麻醉，手术野皮肤消毒，左背部斜切口（左腋后线与肋缘交界下方）

3、0.5～1.0cm，进腹暴露脾脏后，将脾下极轻柔地提出腹腔，用5号针头将结肠癌SW480细胞缓慢注入裸鼠脾脏，每只裸鼠注射细胞悬液0.2ml（即1×107/只），注射时间约3min，可见脾被膜肿胀、变白，注射完毕拔针后以75%乙醇棉棒压迫针眼2min，以压迫止血和杀灭可能外渗的癌细胞，防止腹腔内种植转移。将脾脏放回原位，关腹。麻醉清醒后常规饲养。整个操作过程遵循无菌操作原则。1．3　疗效观察　定期观察裸鼠的一般状况。分别于接种后第1、2、3和4周各处死3只裸鼠，剩余裸鼠待其自然死亡，观察生存期。所有裸鼠均进行尸解，观察有无肝及其他部位转移，取出肝脏、脾脏及有转移的

4、其他组织，以4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后行常规病理组织学检查。72　结果2.1　裸鼠一般状况　术后24只裸鼠全部成活，术后第3天称量体质量，各裸鼠均有所下降，到术后第6天基本恢复到术前水平。术后第3周，部分裸鼠体质量下降、消瘦、少动、进食量减少。第4周绝大部分裸鼠明显消瘦、弓背、行动迟缓、精神萎靡，严重者出现衰竭、死亡。各裸鼠后期均有恶病质表现，其中5只出现腹水，2只出现便血。2.2　肝转移率　尸检发现24只裸鼠肝脏上均有转移瘤形成，肝转移率为100%。2.3　肝转移瘤生长情况　术后第1周处死的3只裸鼠肝脏表面肉眼均可见针尖大小、散在分布的灰白色微小转移灶；第2

5、周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节呈小米粒样；第3周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节增大，弥散分布；第4周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节明显增大且大小不一；自然死亡时，肝脏表面及切面均有灰白色转移灶。转移瘤数目差异较大，部分裸鼠转移结节融合成孤立的大块，最大2.4cm×2.1cm，表面有破溃（图1），部分裸鼠呈多发的粟粒样小结节，难以计数（图2）。肝表面转移结节主要位于肝叶边缘和肝叶脏面，以右叶多见。肝体积变小，质脆硬，部分肝组织被转移结节替代。72.4　脾脏原位肿瘤形成情况及其他部位转移情况脾脏接种局部可见大小不一的灰白色结节，直径0.2～3cm（图3），原位接种成瘤率为100%。部

6、分裸鼠有淋巴结、膈肌、腹腔等一处或多处转移灶（腹腔内广泛转移1只，图4），腹腔淋巴结转移3只，膈肌转移1只，心、肺、脑、肾等未见转移灶。各部位转移灶均经病理证实来自同一腺癌。2.5　形态学观察2.5.1　大体解剖　脾脏原位瘤及肝转移瘤呈灰白色，实质性，圆形或椭圆形，并向周围组织浸润，剖面呈鱼肉状，较大瘤体中央有坏死区。2.5.2　光镜观察　肝转移瘤切片中看不到正常的肝小叶结构。癌细胞生长活跃，呈明显异形性，胞核圆形、居中，核大、深染，核分裂相增多，胞质少，聚集成团，伴有癌结节形成，纤维组织增生及炎细胞浸润较少，与脾脏上肿瘤结节的形态结构相似，符合低分化腺癌的结构特

7、征。部分区域变性坏死、肿瘤细胞结构不清，坏死组织中可见大量炎细胞（图5）。2.5.3　电镜观察　肿瘤细胞呈不规则形，体积较大，核大，核仁明显，核分裂相易见，胞质内细胞器丰富，内质网、线粒体等增多（图6）。肝转移瘤细胞与脾脏原位种植瘤细胞超微结构相似。72.6　生存期　12只荷瘤裸鼠自然生存时间为24～40d，平均（34.72±6.49）d。3　讨论　　实验性结直肠癌肝转移模型的建立主要有脾脏种植法和盲肠壁种植法。其他接种途径尚有门静脉内、回结肠静脉、肝脏注入等，但均因操作困难或其他原因而较少应用。盲肠壁种植法肿瘤转移范围较广，肝转移发生率相对低，且肝转移发展过程较

8、慢；脾脏种