一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究

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1、一种新型速效人胰岛素类似物的构建、制备及性质研究作者：刘素丽,鲁勇,王学军,曹荣月,刘景晶,范豪,李泰明【摘要】目的：构建和制备出一种新型速效人胰岛素类似物(PIns),进行其性质研究。方法：采用加端PCR的方法,扩增出在天然人胰岛素原N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸残基的重构胰岛素原基因片段,将其插入通用表达载体pET28a后,再将经过改构后的硫氧还蛋白(120aa)的基因片段与重构胰岛素原基因的5′端通过赖氨酸连接,成功构建了速效人胰岛素原类似物融合蛋白(FKPPIns)的表达载体(pET28aFKPPI

2、ns)。此融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达,经包涵体洗涤和DEAE阴离子交换树脂纯化后进行复性、酶切。酶切产物经RPHPLC纯化后,质谱法测定其分子量;等电聚焦法测定此蛋白的等电点;凝胶过滤法测定其自身的缔合性质。对新西兰大白兔肌肉注射纯化后PIns,进行初步的药效学评价。结果：获得了结构为RPKPInsulin的PIns纯品,其等电点为7.3,自身缔合性较标准胰岛素显著下降。结论：PIns与标准人胰岛素相比,起效快、达峰时间及持续时间短。【关键词】融合表达;速效人胰岛素类似物;单体胰岛素;药

3、效学活性14常规药用人胰岛素由A、B两条多肽链构成,等电点为5.3,以六聚体形式溶解于中性溶液中。六聚体在皮下不能直接被吸收,必须解聚成二聚体或单体方能透过毛细血管壁进入血液循环而发挥作用。因此,起效时间约为0.5h,作用高峰在1.0～4.0h,持续时间6～8h,药代动力学特征与正常人餐后的胰岛素高水平分泌和餐间及夜晚的低水平基础胰岛素分泌不符,造成临床应用上的局限：(1)使用不便,需要在餐前30min注射,且餐后血糖控制不理想。(2)作用时间较长,容易出现下一餐前的低血糖和夜间低血糖[1]。　　现在已经上市的3种速效人胰岛素类

4、似物(PIns)Lispro、Aspart和Glulisine等电点均在5.3左右,以单体形式存在,起效快，达峰时间及作用时间短,可以较好地模拟和替代餐时胰岛素的分泌,病人可根据进餐的需要及在餐后追加使用,在更好地控制餐后血糖的同时减少了低血糖的发生[2]。以往采用改变与六聚体形成相关的人胰岛素B链上某些氨基酸的方法,来改善胰岛素自身聚合的性质,以达到速效的目的[3]。而我们的实验目的是在不改变天然人胰岛素氨基酸序列的情况下,仅在其B链N端添加精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、脯氨酸4个氨基酸,获得了一种等电点7.3,接近人生理pH值的,

5、缔合性较标准人胰岛素显著降低的PIns。　　1材料与方法14　　1.1材料　　1.1.1菌种和质粒含有标准人胰岛素原基因的质粒(pET28aIns)、含有硫氧还蛋白基因的质粒(pET32a)、表达载体pET28a、大肠杆菌BL21(DE3)，均为实验室保存。　　1.1.2试剂引物由上海英俊生物技术公司合成,限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、Taq酶及T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。Trypsin和羧肽酶B均为Amresco公司产品。人胰岛素标准品为Sigma公司产品。三氟乙酸(TFA)和乙腈为色谱纯,其余试剂均为

6、市售分析纯。　　1.2实验方法　　1.2.1重组质粒的构建及转化用Oligo6.0软件,自行设计引物：　　LysArgProLysPro　　引物1：5′CGGGATCCBamHⅠAAGCGTCCGAAACCGTTT　　GTCAATCAGCACCTT3′;引物2：5′CCCAAGCTTHindⅢAGT14　　TGCAGTAGTTCTCC3′;Gly引物3：5′AAACCATGGNcoⅠGCGA　　Glu　　TGAAATCATCCACCTGACTG3′;引物4：5′TTAGGATCCBamHⅠAGTTTGCGTCAG

7、AGCCAG3′。以pET28aIns质粒为模板,利用引物1和引物2进行PCR扩增反应,反应过程包括94℃变性5min,然后在94℃、45s，58℃、50s，72℃、45s条件下进行30个循环,最后72℃保温5min。扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的表达载体pET28a连接后,得到pET28aKPPIns重组质粒。以pET32a质粒为模板,用引物3和引物4进行PCR扩增反应,反应过程包括94℃变性5min,然后在94℃、45s，57℃、45s，72℃、20s条件

8、下进行30个循环,最后72℃保温5min。扩增后的基因片段纯化后用限制性内切酶NcoⅠ、BamHⅠ切割,切割后的产物与经过同样酶切后的pET28aKPPIns重组质粒连接后,得到pET28aFKPPIns重组质粒。pET28aFKPPIns重组质粒经酶切、