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1、PCR-SSP法基因定型解决临床配血中血型问题赵志弘何路军乔芳田亚娟王振雷张虹刘敬闪【摘要】目的利用ABO基因定型技术解决临床疑难血型定型1例。方法运用血型血清学方法、PCR-SSP(SequenceSpecificPrimer,SSP)基因定型法对比进行1例正反定型不符标本的检测。结果血清学方法不能正确定型。PCR-SSP法基因定型结果是该患者为O1O1V基因型。结论血型基因定型技术较血型血清学方法更准确、可靠，是血型血清学技术的极好补充。【关键词】PCR-SSP;血型血清学;正反定型不符;ABO基因定型;冷凝集素
2、近些年来，随着城市人口的激增，血站不仅在采供血量上增长很快，而且在实际工作中出现了更多的正反定型不符合标本，这些标本有来自血站内部检验科的，也有来自医院临床的。传统的血清学检测方法由于其自身局限性，因此面临很大挑战。笔者在实际工作中运用ABO基因定型方法解决了一些疑难血型定型的常见问题，现以1例临床配血中出现的正反定型不符标本的鉴定报告如下。 1材料与方法5 1.1血型血清学试验 按照文献[1]操作。抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白试剂、标准试剂ABO红细胞、谱细胞均由上海血液
3、生物医药有限责任公司制备。 1.2血型基因定型PCR-SSP;血型血清学;正反定型不符;ABO基因定型;冷凝集素采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术。DNA提取严格按照TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行。引物为采用瑞典隆德Martin.L.Olsson研究小组[2~4]与笔者自行设计，内对照为扩增人类生长激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR扩增仪为美国ABI公司9700。引物混合物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小见表1。引物序列见表2。 1.2.1PCR反应体
4、系总反应体系10μl,引物浓度10pmol/μl,dNTPs浓度10pmol/μl,基因组DNA浓度50ng/μl,15mMMgCl2(SIGMA公司),内对照引物浓度5pmol/μl,5U/μlTaqDNA聚合酶(Promega,Shanghai)，甘油和甲酚红终浓度分别为5%和0.01%(SIGMA公司)。表1基因分型引物检测的基因特异性、突变位点和PCR产物片段大小5 1.2.2PCR循环参数采用热启动DNA变性技术96℃预置7min,然后按94℃30s,66℃30s,72℃1min进行32个循环，再72℃延伸
5、2min。 1.2.3电泳PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴别，电压153V,时间15min，DNAMarkerDL2000为TRAASTM公司产品，凝胶成像仪拍照观察结果(见图1)。 2结果 患者,女,25岁，2011年2月患贫血入住省二院。医院在配血中发现其血型正反定型不符,遂请求本中心配型科鉴定。血清学鉴定结果及基因定型结果分别见表3和图1。表3患者血清学结果图1表3显示：该患者正定型为AB型，反定型为O型。存在正反定型不符合现象。 图1显示：只有1、4泳道扩增出了特异性条带，1、4泳道分别为O1和O1V基因
6、的扩增产物，因此该患者基因型为O1O1V。 3讨论 患者血型血清学结果正反定型不符，正定型为AB型，反定型为O型。因反定型O细胞、自身细胞凝集，提示该献血员血清中存在冷凝集素。37℃水浴后，正定型抗A、抗B、抗A1、抗AB和反定型O细胞、自身细胞凝集消失，证明该患者血清中存在冷凝集素抗体5。至此，定型不符的原因找到。基因定型图谱显示出了其O1O1V基因型：1、4泳道为O1和O1V基因，2、3泳道为A基因，3、5、6泳道为B基因。患者样本只在1、4泳道扩增出了特异性条带。 综上所述，此类标本在血站或医院血库的日常工
7、作中会经常遇到，具有较典型的代表性。此套常规ABO基因定型方法，切合实际，在3h内可完成从DNA抽提到基因扩增的完成，效率较高，相对血型血清学方法，能在较短时间内准确解决疑难血型标本的定型问题。此PCR-SSP法较PCR-RFLP法[3](限制性内切酶法)具有省时、简便的特点。虽然血清学凝集反应是鉴定血型的基本方法，但是有其局限性，而以DNA为检材的基因分型技术，不受血型抗体来源以及生物活性细胞的限制。采用高通量基因分型平台可以检测血型基因变异体。当今，经典免疫血液学和分子免疫血液学很自然地整合在一起，形成了“后基因组
8、时代免疫血液学”。在整合的前提下，血清学方法和基因分型方法取长补短，相互补充，不存在谁取代谁的问题。从提高输血安全性方面考虑，向临床提供基因分型的血液制品，从供受者表型匹配逐步升级到基因型匹配，是今后的发展方向。血清学技术相对比较普及，当前加强分子生物学教育显得刻不容缓[5]。基因定型技术作为血型血清学方法的极好补充，应当为广大血
