as2o3对人恶性淋巴瘤ca46细胞系增殖、活力和细胞周期的影响及机制探讨

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1、As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力和细胞周期的影响及机制探讨【摘要】目的探讨三氧化二砷(As2O3)对恶性淋巴瘤CA46细胞株增殖、活力和细胞周期的影响及机制探讨。方法磺酰罗丹明B(SRB)法观察不同浓度(0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0μmol/L)As2O3分别处理24,48,72,96h后CA46细胞系生长曲线，并计算上述各浓度As2O3处理72h后CA46细胞系的细胞增殖抑制率;观察不同浓度(0.5，1.0，2.0μmol/L)As2O3作用72h后CA46细胞系的克隆形成率;流式细胞仪DNA倍体分析法探讨不同浓度(0.5，1.0和2.0μmo

2、l/L)As2O3作用72h对CA46细胞系细胞周期的影响;RTPCR法检测不同浓度(0.5，1.0和2.0μmol/L)As2O3作用72h后CA46细胞系p16基因mRNA的表达。同时设相应对照组进行比较。结果(1)与未处理组相比，各浓度As2O3均可明显抑制CA46细胞生长，且G0～G1期细胞逐渐增加，呈剂量依赖性。(2)未处理组细胞p16基因呈微弱表达，不同浓度As2O3作用72h后，未处理组、不同浓度(0.5，1.0和2.0μmol/L)As2O3处理组p16基因表达阳性条带灰度值与actin比值分别为(0.11±0.11)，(0.33±0.10)，(0.57±0.11)和(0

3、.67±0.09)，各As2O3处理组p16基因mRNA表达明显高于未处理组，其差别有统计学意义(P<0.01)。结论As2O3可将细胞周期阻滞于G0～G1期，抑制肿瘤细胞的增长，其机制可能与诱导p16基因表达有关。【关键词】砷剂;淋巴瘤;细胞增殖;肿瘤细胞，培养的;11细胞周期;基因，p16三氧化二砷(As2O3)是近年国内首先发现并被成功用于急性早幼粒细胞白血病(APL)等多种恶性血液病的诱导分化治疗的药物;它还被用于治疗慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤等血液肿瘤及神经母细胞瘤等实体瘤，取得了很好的疗效，其报道的作用机制大多与诱导细胞的凋亡和分化有关。笔者拟以恶性淋巴瘤细

4、胞株CA46为受试细胞株，以As2O3为实验药物，研究As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力和细胞周期的影响及可能的机制。　　1材料和方法　　1.1药物选用As2O3(哈尔滨医科大学第一医院产品)，以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配成1mmol/L储存液，使用前用RPMI1640溶液稀释至所需浓度。　　1.2细胞系及细胞培养选用CA46，人恶性淋巴瘤(Burkitt淋巴瘤)细胞株，为福建省血液病研究所冷冻保存，复苏后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养至所用细胞处于对数生长期。　　1.3实验分组取对数生长期的CA46细胞,调整细胞浓度1×10511mL-1,接种于培养瓶中。生长

5、曲线及细胞增殖抑制率实验设7组，即未处理组，As2O3(0.625,1.25,2.5，5.0,10.0,20.0μmol/L)处理组;克隆形成率、细胞周期百分率、RTPCR实验设4组，即未处理组，As2O3(0.5，1.0,2.0μmol/L)处理组。用药后常规培养,培养过程不换液。　　1.4As2O3对CA46细胞增殖、活力和细胞周期的影响　　1.4.1测定As2O3对CA46细胞增殖的影响参照文献[1]，使用全培养液将对数生长期CA46细胞稀释成1×105mL-1单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔90μL细胞悬液，加入不同浓度药物10μL，培养后第24，48，72，96h进行检

6、测。细胞加药培养结束后，加入预冷的80%三氯醋酸溶液50μL，静置5min后再将平板移至4℃放置1h。每孔加入4g/L的SRB液100μL，室温放置10min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，每次300μL，去除未与蛋白结合的SRB，空气干燥。用10mmol/L非缓冲Tris碱液150μL溶解未与蛋白结合的SRB，在酶标仪上用492nm和630nm双波长测吸光度值。　　1.4.2检测生长曲线与细胞增殖抑制率用药后第24，48，72和96h用SRB法检测每个实验组的平均OD值，以吸光度值为纵轴，作用时间为横轴绘制生长曲线。取72h的OD值，比较各组的细胞增殖抑制率，以As2O3浓度为横

7、轴，抑制率为纵轴绘制曲线，由此求出细胞生长抑制50%时的As2O3浓度，即IC50。实验至少重复3次。11　　各加药组细胞增殖抑制率=(未处理组OD值-各加药组OD值)/未处理组OD值×100%。　　1.4.3计算克隆形成率CA46细胞经不同浓度药物作用72h后，洗去药物，用含20%小牛血清的RPMI1640完全培养液稀释为7.0×103mL-1单细胞悬液。于24孔塑料培养板预加1.2%甲基纤维素培养基，每孔1.0mL，