pcr假阴性的原因分析

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1、PCR假阴性的原因分析PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。　　造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：　　1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题

2、（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降(假阴性）等问题.　　2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。　　离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相

3、同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。PCR扩增方面的技术解答1、PCR括增的基本原理　PCR(PolymeraseChainReaction)是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿

4、于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。2、高温聚合酶分类　　高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类：第一类酶具有5’-

5、3’方向的DNA合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如TaqDNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如TthDNA聚合酶。第三类酶具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如PfuDNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能够纠正DNA扩增过程出

6、现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA延伸能力不及其它两类。目前人们试图用各种手段来提高第三类酶的延伸性能，它在现代分子生物学实验中越来越收到重视。3、如何选酶?　　根据扩增产品的用途确定。第一类酶如TaqDNA聚合酶的主要用于检测基因或特定DNA片段是否存在，制备DNA探针，T/A克隆时在DNA片段末端添加单个碱基，和Pfu一道用于较长DNA片段的扩增。这类DNA扩增，DNA片段中可能存在的突变不影响实验结果。　　第一类酶大多数使用场合，第二类酶都可以用。需要注意的是Tth的长链PCR扩增的能力不及Taq酶。人们更多注意的是

7、Tth的逆转录功能，用它来实现基因单管单个酶的RT/PCR扩增检测。和传统的AMV和MMLV逆转录酶相比，Tth的RT是在高温下进行的，能有效的解除RNA中的二级结构，是扩增出的基因更为完整。不足之处：Tth的RT能力不及AMV和MMLV逆转录酶。第三类酶以PfuDNA聚合酶为代表。　　Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它扩增出的DNA产物，随机突变少，保证性能为TaqDNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表达基因片段的合成，用于DNA突变实验。如果要求扩增DNA片段中的错误特别少，减少下游分子操作不必要的回复突

8、变工作。高保真DNA扩增，使用PfuDNA聚合酶是唯一的选择。需要指出的是：用Pfu的DNA扩增，突变少，但不是无突变无错误扩增。Pfu的不足之处是扩增能力较差，2kb以上的基因扩增需要优化反应条件。　　将第一类或第二类与第三类酶按特