微生物的化学诱变技术

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1、微生物的化学诱变化学诱变：利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。复合处理及其协同效应：诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。定向培育和驯化：定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变

2、异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。微生物化学诱变的操作过程化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，移取液体时绝对禁止直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防止污染环境，造成公害。一、碱基类似物用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5-IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5-BU和AP。当将这类物质加入到培养基中，在繁殖过程中可以掺入到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代

3、核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺入诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。（一）碱基类似物的诱变机制正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。5-BU导致A:T碱基对转换为G:C碱基。2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A:T－G:C或G:C－A:T的转换。（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）1．单独处理将微生物液体培养到对数期，离心除去培

4、养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8~10h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25~40μg/mL，温合均匀，取0.1~0.2mL菌悬液加入到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为0.1mg/mL。2．与辐射线复合处理据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂，从而提高突变率。二、烷化剂

5、（一）烷化剂的作用机制烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂含有硫芥、氮芥。烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞

6、嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10%左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。（二）烷化剂的性质溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的缓冲液。千万要注意烷化剂有毒！！！！（三）常用的烷化剂亚硝基胍（NTG）：黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变为绿色时，诱变效应际低。有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液。诱变处理方法：①用一定值

7、的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液9mL:NTG丙酮溶液lmL，浓度为NTG1mg/mL；使用时取母液0.2mL+菌悬液1.8mL，NTG终浓度为100μg/mL。一般随菌种不同而异，细菌一般为100~1000μg/mL，放线菌、真菌为l000-3000μg/mL。③放线菌在生长适宜的温度下培养，（细菌30~35℃、真菌25~28℃、放线菌30~32℃）处理若干时间，一般细菌20~60min，孢子90~120min。④终止反应。冷的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀

8、释度分离于平皿。如果是细