从大蒜细胞中分离纯化出超氧化物歧化酶[1]

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1、从大蒜细胞中分离纯化出超氧化物歧化酶[1]-----------------------Page1-----------------------万方数据-----------------------Page2-----------------------48200J，V甜．22，N09《食品科学》※工艺技术表I热变前后的处理结果比较543蛋白质作为一种两性物质存在着等电点，当溶液2的pH处理某蛋白质的等电点时，该蛋白质在溶液中缸鼎。犁碍一i}_一一0的静电荷为零，溶解度最小。利用不同蛋白的等电点

2、一Ki＼o哩譬：g＼n)蝗奇自。啦0都处在酸性或弱酸性范围，我们考察了溶液pH值的涮方法纯化目标蛋白。由于大多数植物蛋白的等电点都丙耐加入晕‘v／v、处在酸性或弱酸性范围，我们考察了溶液pH值在图2丙酮分级沉淀法处理结果2．5～7．0范围内的处理情况(图1)。当pH2．5—4．0奄时，总蛋E1浓度很低，较初始值467mg／m1下降了目j田80％左右，表明大部分蛋白质都变性沉淀下来。由于：鼎嫂[^sOD酶活较初值5336u／mJF降幅度较低，仅30％左窖旃：E闯右，因此可以推断出变性沉淀的多为杂蛋

3、白。在pH值?j为3．O时s0D比活达到最高，此时纯化效果最好。pH烬己灌大于4．0后，总蛋白浓度逐渐恢复到初始水平，说明。m帅帅砷舯铀∞Ⅷ∞m董j大部分杂蛋白的等电点都小于4．0，在此范围内调整pH达不到纯化sOD的目的。丙剩加人量{v／vJ抽提液先嗣节pH全3o，离心去除沉淀物后再加人丙酮。j图3等电点沉淀和丙酮分级沉淀法串联结合使用的处理结果；二缸：喃果。首先将热变后的抽提液的pH值调节至3(J，离心茹工=萍后再分级加入丙酮。图3的结果表明当丙酮加入量为鼍讯(I．0v／v时，处理液的s01

4、)比活达到IoOu／mg左右，即j≤纯化倍数达到10倍，纯化效果比单步的等电点沉淀誊邑一和丙酮分级沉淀法有明显的改善。我们还可以注意到，在等电点沉淀法与丙酮分级沉淀法串联使用的工艺DH中，当控制在最佳条件，即pH为3，0，丙酮加入量为1．ov／图l等电点沉淀法处理结果v时，溶液中总蛋白浓度从调节pH前的4．67mg／ml下降!．3丙酮分级沉淀法到最终的O．3‰g／ml，下降幅度达到92％，而提取液中在蛋向质溶液中加入一些弱极性有机溶剂改变sOD酶活在处理前后变化都不大，只从最初50．84u／ml

5、溶液的介电常数，口r使不同种类的蛋白质的溶解度产下降到晟终的38．30u／ml，s0I)的收率达到75％以上，可生不同程度的下降，因此该法可用来纯化蛋白质。但见在该串联工艺中杂蛋白的去除率还是很高的。·般传有机溶剂大多都带有一定的毒性，易使蛋白质构象发统[业方法的s0D收率只能达到60％…，从这一点来看生变化而导致变性，所以在纯化过程中一般采用毒性我们采用的纯化方法在经济上也较为有利的．较小的丙酮以尽量消除这种副作用。图2为在经热变2．4硫酸铵盐析法后的大蒜抽提液中丙酮加入量为o．4～l，2v，

6、7v时的处理盐析法是工业上一种常用的纯化蛋向质的方法，结果：当丙酮加入量达到lm／v时，sOD比活达到最高，其原理是在高浓度的电解质盐溶液内蛋白质分子表再加入丙酮将导致sOD酶活急剧下降，因此当以去除杂面的水化层被破坏，使蛋白质分子中的憎水区域裸露蛋白为目的时，丙酮的加入量不宦超过1．m／v。而导致蛋白质分子聚集沉淀。硫酸铵由于价廉、溶解由图2可知丙酮分级沉淀法的最大纯化倍数仅度大，且能使蛋白质性质保持稳定而成为最常用的盐为3倍，而等电点沉淀法为5倍左右。为寻求最佳纯析剂。考虑到前面的实验结果，

7、我们考察了等电点沉化途径，我们考察，将这两种方法合并使用的综合效淀法和盐析法综合使用的处理效果(图4)。当硫酸铵万方数据-----------------------Page3-----------------------※工艺技术《食品科学》200J，vo』．22，‘Ⅳ。949的。大蒜soD抽提液先经热变一等电点沉淀一丙酮分级沉淀三法合用得到10倍以上的纯化效果，去除其中鬣大部分杂蛋白后，再在所得纯化液巾加入l2～1．4v／v袭的丙酮使soD伞部沉淀下来，离心收集沉淀物，然后重蓼新悬浮于少量缓

8、冲溶液中就可进行卜一步的层忻分离罩以制备精品。邑喜{=岳兰¨¨511芒芒兰≯3结论{、II—l，s0·饱和腰{％J通过对从大蒜细胞抽提液中分离纯化s0D的T抽提藏先调节pH至3o，离心去障沉淀物后再加^硫酸镄。艺途径的研究探索，发现把热变性法、等电点沉淀法图4等电点沉淀法和硫酸铵盐析法串联结合使用的处理结果和丙酮分级沉淀法结合起来串联使用足一种好的纯化途径，在pH3．0．丙酮加入最为1．0v／v时能得到最饱和度达到80％时，纯化效果最佳，但纯化倍数显然佳的纯化效果。低于等电点沉淀法和丙酮分级沉淀