车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及种类鉴定

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1、车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及种类鉴定【摘耍】目的从车前草中分离纯化超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,S()D)O方法采用40%乙醇作为提取液，经过丙酮沉淀，CM-SepharoseFastF1ow和SephadexG~75柱层析，收集活性峰，冷冻干燥后即得。结果纯化的SOD经SDS-PAGE显示单一条带，亚基分子量为20.1KDa；抑制试验显示为Fe-SODo结论通过两步柱层析从新鲜车前草提取液屮纯化得到Fe-SOD,其亚基分子量、颜色、紫外吸收与文献报道相近。【关键词】车前草；纯化；超氧化物歧化酚车前

2、草乂名车前、车轮菜、猪耳草等，为车前科植物车前(PlantagoasiaticaL)、平车前(P.depresssaWilld)[1]的干燥全草。车前以种子和全草入药,用于治疗小便不利、水肿、暑热泄泻、痰多咳嗽、热毒痛肿等。随着现代中药化学的不断发展，从车前中分离出许多有效成分[2]：①多糖类；②黄酮及其苗类，如：木樨草素；③环烯瞇祜类，如：桃叶珊瑚^(aucubin)＞京尼平貳酸(goniposidicacid)等；④苯乙酰咖啡酰糖酯类，如：连翘酯貳Qcteoside)；⑤还有熊果酸、乌苏酸、生物碱、小分子的酸性物质、谷帑醇昔

3、等，从而揭示了部分传统药效的作用机制，还发现了许多传统用药所没有的新的药理作用，女口：镇咳祛痰、平喘、抗衰老、缓泻、抗菌等。但是对车前草屮大分子成分如蛋白、多糖等的研究很少，车前草超氧化物歧化酶的分离提纯文献尚未见报道。本文探讨了从车前中分离纯化超氧化物歧化酶的方法并鉴定其种类，为植物性超氧化物歧化酶的应用提供依据。1材料与仪器1.1材料车前草购自广州程岗路农贸市场，由广州军区广州总医院邓伟杰主管药师鉴定为车前科植物车前（PlantagoasiaticaL）的干燥全草。1.2主耍仪器凝胶层析系统（LKB）（PharmaciaBi

4、otech）；二两装高速屮药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；GeneralTU-1901紫外分光光度计（日本岛津公司）；LGJ12冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；SorvallRC-5C低温高速离心机；电子天平TP-320A（湘仪天平仪器设备有限公司）;电子天平BP210SSartorius（德国）；垂直电泳仪（BI0-RAD）；TGL-16H台式离心机（Beckman公司）；UniversalhoodII凝胶成像系统（BIO-RAD）；BYQ6044-383恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；PHS-25

5、CpH计（上海康仪仪器冇限公司）。1.3主要试剂超氧化物歧化酶（华灿生物制药技术公司）；超氧化物歧化酶活性测定盒（南京建成生物工程研究所）；葡聚糖凝胶（G-75）丿新填斗（Pharmacia公司）；CM-SepharoseFastFlow（Pharmacia公司）；三轻甲基氨基甲烷（Tris）（德国Merck公司）；TEMED（BI0-RAD）；丙烯酰胺（上海奥伯生物科技有限公司）；N-N亚甲基双丙烯酰胺（广州化学试剂厂）；十二烷基磺酸钠（SDS）（广州威佳科技有限公司,进口分装）；过硫酸鞍（APS）宝泰克公司）；考马斯亮蓝R-

6、250（中国医药上海化学试剂公司）；牛血清白蛋口（BSA）（中国科学院上海生物化学研究所）；小分子蛋口质分子量标准（Mark）（Takara宝生物工程有限公司）;透析袋（分子量8000-15000）（北京鼎国生物公司）。2方法2.1酶活力的测定采用南京建成生物工程公司的S0D活性测定试剂盒测定样品酶活力。酶活力单位：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）,计算公式：总SOD活力（U/mL）二A对照-A样品/A对照一50%X反应体系的稀释倍数X样本测试前的稀释倍数2.2蛋白质浓度的测定采用B

7、radford法测定蛋白质浓度，最低检出量为1ug蛋白/讥。2.3酚的分离纯化2.3.1乙醇提取液浓度的确定取新鲜车前草用蒸馅水洗净，甩干表面水分，称取9份，每份50g,分成3组，粉碎后分别用30%,40%,50%（e）乙醇100mL,4°C浸提4h,4层纱布过滤后收集滤液4000r/min离心1min,取上清液用量筒稀释至150mL,测定样品中的蛋白浓度和SOD活性，总体比较采用单向方差分析，多重比较采用LSD法，结果见表1。方差齐性检验：F二0.698,P二0.534；三组数据总体差异显著（28.801,P二0.016）；多

8、重比较1:2（P二0.010）,1:3（P=0.011）,2:3（P二0.942）。故选择比活较高的40%乙醇作为提取液。表1不同浓度乙醇提取后比活比较（略）Tab・1Comparisonofspecificactivitiesafterextractionwi