细胞色素p450酶系总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（

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1、细胞色素P450酶系总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞色素P450酶系（CYP-ECOD）总活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过乙氧基香豆素脱乙基酶反应系统中乙氧基香豆素转化为羟基香豆素后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶系活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素P450酶系的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景细胞色素P450酶是肝细胞微粒体复合功能单加氧化酶系统的总称。其分成五十多个亚酶：CYP1至CYP51。作用在于体内外源化

2、合物（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation）。乙氧基香豆素脱乙基酶（7-ethoxycoumarinO-deethylase；ECOD）的活性是细胞色素P450酶系的诊断标记，其基于ECOD广泛性催化细胞色素P450亚酶的活性。乙氧基香豆素（7-ethoxycoumarin）在乙氧基香豆素脱乙基酶的催化下，转化为羟基香豆素（7-hydroxycoumarin）后荧光峰值的变化（激发波长368nm，散发波长456nm），来定量测定细胞色素P450酶系的活性。乙氧基香豆素脱

3、乙基酶反应系统为：ECOD7-ethoxycoumarin+NADPH→7-hydroxycoumarin+CH3CHO＋NADP+产品内容缓冲液（ReagentA）5毫升反应液（ReagentB）500微升底物液（ReagentC）125微升终止液（ReagentD）2毫升标准液（ReagentE）100微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，反应液（ReagentB）、底物液（ReagentC）和标准液（ReagentE）避免光照，终止液（ReagentD）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器培养箱：用于孵育反应20

4、0微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器荧光分光光度仪过荧光酶标仪：用于荧光分析3实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、测定准备1．准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里2．设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长370nm，散发波长450nm，并置零3．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管4．分别加入25微升缓冲液（ReagentA）到每个离心管5．移取25微升标准液（ReagentE）到1号管，混匀6．小心移取25微升1号管稀释的标准液（ReagentE）到2号管，混匀7．小心移取25

5、微升2号管稀释的标准液（ReagentE）到3号管，混匀8．小心移取25微升3号管稀释的标准液（ReagentE）到4号管，混匀9．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号缓冲液（ReagentA）标准液（ReagentE）测定体系标准羟基香豆素浓度125微升25微升1微摩尔/升225微升25微升1号管0.5微摩尔/升325微升25微升2号管0.25微摩尔/升425微升25微升3号管0.125微摩尔/升525微升空对照0二、标准曲线测定1．移取155微升缓冲液（ReagentA）到1.5毫升离心管2．加入20微升反应液（ReagentB）3．加入5微升底物液（Rea

6、gentC）4．加入20微升上述配制的标准样品5．上下倾倒数次，混匀6．在37℃温度下孵育15分钟，避免光照7．加入75微升终止液（ReagentD），混匀8．在37℃温度下孵育5分钟，避免光照9．转移到新的比色皿或黑色96孔板10．即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（RelativeFluorescenceUnit；RFU）11．实际荧光单位：标准样相对荧光读数－5号管标准样荧光读数（作为空对照）12．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为实际相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准羟基香豆素浓度（微摩尔/升）三、样品测定31．移取155微升缓冲液（Reagent

7、A）到1.5毫升离心管2．加入20微升反应液（ReagentB）3．加入5微升底物液（ReagentC）4．加入20微升待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）5．上下倾倒数次，混匀6．在37℃温度下孵育15分钟，避免光照7．加入75微升终止液（ReagentD），混匀8．在37℃温度下孵育5分钟，避免光照9．转移到新的比色皿或黑色96孔板10．即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（Relativ