酶活性化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）.doc

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1、细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞NADPH氧化酶活性化学发光法定量检测试剂是一种旨在使用化学发光分子光泽精受到NADPH氧化酶催化产生的超氧阴离子O2-的还原，然后在其还原过程中释放能量，由此测定样品中特异性氧化还原酶（oxidoreductase）的活性，即采用发光探测仪（Luminometer）测定其相对冷光单位（RLU）的变化，以此进行测算酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞样品（动物或人体）还原型烟酰胺腺嘌呤

2、二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景NADPH氧化酶，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reducednicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase；NADPHoxidase；EC1.6.3.1）或还原型辅酶II氧化酶，是机体防御机制中的重要元素。NADPH氧化酶由6个亚体构成：RhoGTP酶（R

3、hoguanosinetriphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocyticoxidase）。其中主要包含细胞膜嵌合蛋白质分子（gp91phox、p22phox、flavocytochromeb558等），以及位在细胞质内的蛋白质分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。细胞膜上的NADPH氧化酶被激活，将还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转变为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），氧分子

4、则获得电子形成超氧阴离子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧阴离子产物具有杀死微生物的功能。NADPH氧化酶异常将导致慢性肉芽肿病（ChronicGranulomatousDisease；CGD）。基于底物NADPH，受到NADPH氧化酶的催化作用，产生超氧阴离子O2-，进而超氧阴离子将化学发光分子光泽精（lucigenin）还原，并释放能量，通过发光探测仪（Luminometer；470nm波长）检测，来测定NADPH氧化酶的活性。其反应方式为：NADPHOxidaseNADPH+O2+FAD→

5、NADP－+FADH2+O2－O2－+LUCIGENIN→light产品内容清理液（ReagentA）60毫升裂解液（ReagentB）10毫升缓冲液（ReagentC）20毫升反应液（ReagentD）500微升阴性液（ReagentE）1毫升底物液（ReagentF）2.5毫升专性液（ReagentG）200微升产品说明书1份4保存方式保存清理液（ReagentA）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（ReagentD）和底物液（ReagentF），避免光照，有效保证6月用户自备

6、15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器微型台式离心机：用于样品制备细胞刮脱棒：用于细胞脱离恒温培养箱或恒温水槽：用于反应物孵育专用测定杯或黑色96孔板：用于冷光测定的容器化学发光仪：用于冷光分析实验步骤测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为30℃预热和运行程序（清洗步骤等），然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；反应液（ReagentD）和底物液（ReagentF）注意避光。然后进行下列操作。一、样品准备1．准备好25cm2细

7、胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）2．小心加入3毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面3．小心抽去清理液4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）5．加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g8．小心抽去上清液9．加入500微升裂解液（ReagentB），充分混匀10．转移到预冷的1.5毫升离心管11．强力涡旋震荡15秒12．置于冰槽里孵育30

8、分钟13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管，置于冰槽里——此为细胞总蛋白15．同时加入200微升裂解液（ReagentB）到颗粒管16．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器17．在冰槽里用研磨棒匀化组织颗粒（约80下）18．转移到到另一个新的预冷的1.5毫升离心管——此为细