基于maldi-tof质谱技术的病原体快速检测

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1、基于MALDI-TOF质谱技术的病原体快速检测病原体临床检测需要有高通量，高精确度，快速的技术方法。基于质谱测定的病原体检测技术既纳入了PCR技术的优势，可以对微量或无法体外培养的病原体进行扩增，同时也融入了MALDI－TOF质谱检测的RNA片段的快速、精确、高通量的特性。我们确定了一些常见细菌的管家基因（如16sRNA，DNAGyrase，Hsp70等）的特定片段，尽管它们高度保守，但仍在序列上存在一定的差异。经过PCR扩增，体外转录以及核酸内切酶RNaseT1作用，这些差异将产生不同的RNA片段质谱图谱，以作为细菌鉴别的标准。实验材料菌株E.coli(atcc25922)S

2、almonellatyphimurium(atcc14028)均为标准菌株试剂PCR，体外转录试剂:购于FermentasMaldiTof基质:2’,4’,6’-trihdroxyacetophenone(THAP)；3-hydroxypicolinicacid(3-HPA)；6-aza-2-thiothymine(ATT)购于sigma实验方法通过BLAST我们确定了16SrRNA，Hsp70，RNAPolB等候选管家基因，通过Clustal将不同细菌的管家基因序列比对，我们寻找长度在300-600bp,保守性较低的区域作为目标片段。再目标片段上下游设计通用引物，其中正向/负

3、向引物5’端分别附加有T7（Gtaatacgactcactataggg）/Sp6(Atttaggtgacactatagaa)启动子序列。鉴定方法主要依赖于不同细菌RNA酶解片段的质核比的比对,考虑到尿嘧啶（UTP）的质量（306.2Da）与胞嘧啶（CTP）质量（305.2Da）相差只有1Da，两种核苷酸的质量差异太小将会降低该方法的可靠性。在体外转录体系中我们选择用amino-allyluridine(aaU)完全替代普通UTP，使得U与C之间的质量差增至55Da，大大提高了该方法的分辨率。结果与讨论PCR扩增泳道顺序为：1:E.Coli-16sRNA-1;2:E.Coli-1

4、6s-RNA-2;3:E.Coli-16sRNA-3;4:E.Coli-DNAGyrase-1;5:E.Coli-DNAGyrase-2;6:DMAladder;7:Salmonella-16sRNA-1;8:Salmonella-16sRNA-2;9:Salmonella-16sRNA-3;10:Salmonella-DNAGyrase-1;11:Salmonella-DNAGyrase-2由图可以看出PCR引物设计合理，可以得到预计大小的特异性条带。用标准样品探求不同基质的效果我们取用三种DNA标样:STD-1GTTATATT(2414.6Da);STD-2:AGTGATT

5、TTGT（3377.3Da）;STD-3:AGTGATTTTGTGTTATATT（5850.98Da）来进行研究由图可见，ATT和THAP为基质时,标样的峰图比较杂，且不见约5800Da的大片段。而以3-HPA为基质的组中,标样的峰比较清晰，强度比较大，并且清晰可见三个标样的峰，与理论质量相符合。考虑到长的核酸片段将能更好的作为区分不同的细菌，我们希望尽可能多的检测到清晰的大片段的质荷比信息，因而我们初步选定用3-HPA作为基质进行细菌样品研究。ziptip和oligobeads的脱盐效果，对于STD样品来讲，并没有很显著的差异。这可能是由于STD样品本身溶于ddH2O，并没有

6、很多盐离子的在溶液中，所以无法比较两种脱盐方法的优劣。为了比较ziptip和oligobeads两种脱盐方法，选用了RNA酶解样品来进行实验由图可见，对于同样的RNA酶解样品，由于溶液中含有PCRbuffer，转录buffer，酶，dNTP，NTP等成分，可以比较得出ziptip脱盐效果比oligobeads脱盐效果好很多。ziptip脱盐得到的质谱峰图中每个峰清晰，峰强度高，并且检测到的峰的数量也大大多余oligobeads组。由此我们最终决定选用3-HPA作为核酸检测的基质，并采用ziptip脱盐方法。E.Coli与Salmonella图谱比对我们选择了E.coli/Sal

7、monella-16sRNA,DNAGyrase以及Hsp70管家基因片段，做体外转录，RNaseT1酶解，ziptip脱盐，得到MaldiTof图谱。可以看出，图谱的整体趋势是比较类似的，特别是对于一些强度较高的峰以及质核比较小的峰，在两张图谱中均可找到。可能的解释是因为首先管家基因在不同细菌种类间本身保守，并且16sRNA基因又是其中高度保守的一种，这点在我们进行引物设计的时候已经发现。另外，较小的峰代表较短的片段，在基因组中本身重复出现的几率就大一些。但是我们仍然可以在两张图谱中找到一