菠萝蛋白酶的制备及活性测定

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1、菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(AnanaCOmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，eta1．，1964)。1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Ma

2、rtin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(StembromelainE．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(FruitbromelainE．C．3．4．22．5)。Murachi和Neurath、E1．Gharbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。OtaSetaL研究指出，茎菠萝酶分

3、子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli的分析结果相似。1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白

4、酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木糖(xylose，xyl)、岩藻糖(fucose，Fuc)、甘露糖(mannose，Mall)和N一乙酰葡萄胺(N．aceltylglucosamine，GIcNAC)组成用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为33200D，等电点为pH9．55，酶液的最大吸收波长为280nm，0．051％浓度的酶液在280nm的光吸收值达0．984(Murachi，eta1．，1964)。分子中有4个

5、N一乙酰化的氨基己糖，含糖2．1％，分子中有285个氨基酸残基，含氮量为15．88％。在Murachi等研究的基础上，1989年，Ritonja等排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有20种氨基酸，共212个，C端的氨基酸为谷氨酸(Glu)，N端的氨基酸为丙氨酸(Ala)，相对分子质量为23828。菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、pH、金属离子等的影响。研究表明(章佩芬等，1999)：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于55～60℃，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在6．5～7．5，在7．1附近达最大值，在酸性

6、环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的pH范围在3．5~4．5；菠萝酶反应影响不大，MgCl2、CaCh对酶有一定程度的抑制作用。生产过程中，为了保护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂，如EDTA、维生素C、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。1999年，H．H．Liang等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热稳定性，延长酶的半衰期。1．3菠萝蛋白酶的提取纯化方法．菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法主要有三种(王平诸等，2002)：高岭土吸附法、单宁沉淀法、

7、超滤浓缩法。流程(1)高岭土吸附法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(高岭土吸附)一吸附物(洗脱、压滤)一洗脱液(盐析)一盐析物(离心)一湿粗酶饼(溶解、过滤)一澄清液(沉淀)一湿酶(干燥)一精品(2)单宁沉淀法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(加稳定剂)啼稳定液(加单宁)一单宁沉淀物(洗脱)一滤液(干燥)一酶制品(3)超滤浓缩法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(超滤浓缩)一浓缩液(降温、加沉淀剂、沉淀)一湿酶(减压干燥)一酶制品 步骤2．4．1．1酪蛋白溶液的配制称取酪蛋白0．609，加0．05mol／L磷酸

8、二氢钠溶液80mL，搅拌溶解后，加0．1mol／L盐酸液调节pH至7．0，加水至100mL即得。2．4．1．2酶稀释液的配制称取L．半胱氨酸0．269