NYT675-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCP方法.pdf

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1、NY/T675-2003月p吕本标准由农业部科技教育司提出。本标准起草单位:中国农业大学、上海市农业科学院、中国农业科学院生物技术所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人:罗云波、黄昆仑、张大兵、贾士荣、彭于发、金芜军、李宁、汪其怀。本标准首次发布。NY/T675-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法范围本标准规定了转基因大豆及其产品的定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗草甘麟大豆及其产品、转基因抗草丁麟大豆及其产品、转基因高油酸大豆及其产品，包括大豆种子、大豆、豆粕、大豆粉、大豆油及其他大豆

2、制品中转基因成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3原理针对转基因抗草甘麟大豆(GTS40-3-2)含有的CaMV35S启动子、no:终止子、矮牵牛花的CTP4,C

3、p4-epsp:基因以及大豆内标准基因lectin，设计特异性引物进行PCR扩增，以检测试样中是否含有转基因抗草甘麟大豆的成分。转基因抗草丁麟大豆和转基因高油酸大豆含有共同的元件CaMV35S启动子基因以及内标准基因lectin，用上述的引物进行PCR扩增以检测试样中是否含有转基因抗草丁麟大豆和转基因高油酸大豆的成分。4试荆与材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂;配制好的溶液经高温灭菌后使用。4.1各10mmol/L的四种脱氧核糖核昔酸(dATP,dCTP,dGTP,dT丁P)混合溶液。4.210mol

4、/L氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠80g，先用160ml水溶解后，再加水定容到200ml4.3500mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液:称取乙二胺四乙酸二钠18.6g，加人70m工_水中，再加人10mol/L氢氧化钠溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10moll氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容到100ml，在103.4kPa灭菌20min.4.450XTAE缓冲液:称取Tris242.2g，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL500mmol/LEDTA的水溶液(pH8.0)，用冰乙酸调pH

5、至8.0，然后用水定容到1000ml。4.5TaqDNA聚合酶(5单位/,,I-)及IOXPCR反应缓冲液(含25mmol/LMg')。4.610mg/mL澳化乙锭溶液注:澳化乙锭(EB)有致癌作用，使用时要戴一次性手套。4.7DNA分子量标记(DNAMolecularWeightMarker),4.81mol/LTris-HCI(pH8.0)溶液:称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，用水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20mine4.9TE缓冲液(pH8.0):

6、1mol/LTris-HCI(pH8.0)10mL和500mmol/LEDTA(pH8.0)溶液2mL，用水定容至1000mL.NY/T675-20034.10加样缓冲液:称取澳酚蓝250mg，加水10mL，在室温下过夜溶解;再称取二甲苯腊蓝250mg,用10mL水溶解;称取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL，在4℃中保存。4.11引物。4.11.1lettin基因。Le}F1:5'GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3';Lee-Rl,5'GCCCATCTGCAAGCC

7、TTTTTGTG3性预期扩增片段为118bpe4.11.235S-CTP4基因。SC-F1:5'TGATGTGATATCTCCACTGACG3';SC-R1:5'TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3';预期扩增片段为172bp,4.11.3Cp4-epsps基因。CE-Fl.5'CCTTCATGTTCGGCGGTC丁CG3';CE-R1:5'GCGTCATGATCGGCTCGATG3';预期扩增片段为498bp,4.11.4no、终止子基因。Pnos-F1:5'GAATCCTGTTCCCGGTCTT

8、G3';Pnos-R1:5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3';预期扩增片段为180饰。4.11.5CaMV35S启动子基因。35S-F:5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3';35S-Rj，GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3协预期扩增片段为195bp,4.12引物溶液:用TE缓冲液(pH8.0)分别将上述引物稀释到25ymol/L,4.13PCR产物回收试