NYT549-2002赤羽病细胞微量中和试验方法.pdf

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1、ics11.220B411/中华人民共和国农业行业标准NY/T549-2002赤羽病细胞微量中和试验方法Cellsmicroneutralizationtestforakabanedisease2002一08一27发布2002门2一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T549-2002前言赤羽病(akabanedisease，又名阿卡斑病)是由赤羽病病毒(akabanediseasevirus)引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病。该病以流产、早产、死胎、畸形产为特征，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑症。本病的病原是赤羽病病毒，属布尼病毒科布尼病毒

2、属，病毒表面有两种糖蛋白(G1和G)，它们分别诱导中和抗体和血凝抑制抗体产生。本病的血清学诊断方法为细胞微量中和试验。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准主要起草人:周立桥、李昌琳、封启民、李其平。xY/T549-2002赤羽病细胞微t中和试验方法1范围本标准规定了赤羽病(akabanedisease)细胞微量中和试验技术要求。本标准适用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群体抗体水平的评估。2材料准备2.月..96孔细胞培养物，移液器(50pL,200pL)滴头，无毒透明塑料胶带

3、，小试管。Z六2Vero细胞或SVP细胞.Z内嘴曰抗原、标准阳性血清、标准阴性血清。Z被检血清，无菌采集，不加防腐剂。3操作方法3.1准备3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒(AKV)，用199细胞培养液稀释成100TCIDsa/50pL，作为工作浓度抗原。3.1.2被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清均56℃灭活30min，用199液做1,4稀释(即50pd_血清加人150pI,199液中)。3.1.3按常规微量中和试验法每个样品接种4孔，每孔分别加被检稀释血清和工作浓度抗原各501A，轻轻振荡培养板使抗原与稀释血清充分混合，将培养板加盖置37℃培养

4、箱内中和1h,3.1.4每孔滴加SVP细胞或Vero细胞悬液(20万/mL)100pL，用透明塑料胶带封板，置37'C温箱内培养，用倒置显微镜观察细胞病变情况(通常72h内引起细胞病变)。3.2对照设里每次试验均要设置标准阳性、阴性血清对照、病毒对照、正常细胞对照和抗原实际用量的回归滴度对照。3.2.1标准阳性、阴性血清对照，将已稀释好的标准阳性、阴性血清分别加人培养板4孔内，每孔50匹，然后各孔加人工作浓度抗原50川，、_3.2-2病毒对照:将工作浓度抗原滴加培养板4孔内，每孔50pL，补加细胞生长液50川。3.2.3将以上三种对照置37'C温箱内1

5、h，然后于各孔内加人100pL细胞悬液，置37`C温箱内培养，72h后在倒置显微镜下观察结果。3.2.4正常细胞对照:于培养板4孔内各加100PI细胞悬液，然后再于各孔补加细胞生长液100PI。3.2.5抗原实际用量的回归滴度的测定:在每次试验中，应对使用的100TCIDso/50pL抗原进行实际用量的测定，将工作浓度抗原作10倍递增稀释到10-1，每个稀释度接种4孔，每孔50uL，立即补加细胞生长液50pL,置370C温箱内1h，然后每孔加人100pL细胞悬液，计算该试验中TCID,o/50IL的实际用量。4结果判定4.1将培养板放置37'C温箱内培

6、养72h进行初判,120h进行终判。在倒置显微镜下检查细胞病变xY/T549--2002(CPE)。当病毒抗原对照、标准阴性血清加抗原对照均出现细胞病变，标准阳性血清加抗原对照，无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，正常细胞对照亦正常，病毒抗原实际用量在30TCIDso/50pL-300TCIDso/50川范围内方能判定结果，否则被认为无效。4.2判定标准:定性试验判读标准是被检血清在1:4及1:4以上稀释度能使50%及50%以上的细胞孔不出现病变者判为阳性。抗体效价滴定的判读标准是以被检血清的最高稀释50%及50%以上的细胞孔不出现病变为该被检血清的中和

7、效价。