SNT1421-2004-猪水疱病病毒微量血清中和试验.pdf

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1、rI中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1421-2004猪水疙病病毒微量血清中和试验Micro-serumneutralizationtestforswinevesiculardiseasevirus2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局SN/T1421-2004..J‘.曰‘.ol1青本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录.本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:杨素、潘文波、廖秀云、冯家望。本标

2、准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1421-2004猪水疙病病毒微t血清中和试验范围本标准规定了猪水疙病病毒微量血清中和试验方法。本标准适用于猪水疙病病毒中和抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准2.1CPE:致细胞病变作用。TCID,o:半数细胞感染量。SVD:猪水疤病。原理特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。本标准规定的中和试验是以定量病毒稀释血清为基础，

3、当血清能阻止定量病毒50%致细胞病变能力时，其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定猪水疙病血清抗体的方法。试荆和材料4,1本标准所用试剂配制见附录A,4.2本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。4.3本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。4.4病毒:用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的猪水疙病病毒作为标准病毒。4.5标准血清:标准阴性血清采用无SVD病毒抗体的猪血清，标准强阳性和弱阳性血清采用SVD病毒感染发病后康复的猪血清。4.6细胞系:IB-Rs-2传代细胞系.4.7细胞培养液:含10%胎牛血清(经56

4、0C,30min灭能)及抗生素的细胞培养液。4.8细胞维持液:含2纬胎牛血清(经56-C,30min灭能)及抗生素的细胞维持液。4.9细胞分散液。4.10固定液。4.11染色液。5器械和设备5.1二氧化碳培养箱、微量振荡器、倒置显微镜、冰箱、超声波细胞破碎仪.5.2100mL细胞培养瓶、96孔微量细胞培养板、吸头、多道可调移液器、单道可调移液器.SN/T1421-20046预备试验6.1将SVD病毒接种IB-Rs-2细胞单层，37℃吸附Ih后加人维持液，置5%二氧化碳培养箱于37`C培养，接种24h后用倒置显微镜逐日观察，待CPE达7

5、5%以上，冻融一次或置冰浴中用超声波处理(40pA,lmin),2000r/min离心20min，上清液分装小瓶，每瓶1mL，置一70℃保存备用。6.2病毒毒价的测定及其工作浓度的配制:将病毒原液用细胞维持液做10倍系列稀释至I,)-，每个稀释度作8个孔，每孔50pL，每孔加50pL工作细胞液，再补充细胞维持液50pL。每块板设4孔正常细胞对照，于5写二氧化碳培养箱37'C培养，从48h开始至96h用倒置显微镜逐日观察记录CPE，按Karber方法计算TCID;o。将病毒原液配制成100TCID;o/50pL，备用。6.3将标准阳性血

6、清、阴性血清、被检血清经560C30min灭能，备用。6.4将细胞用细胞培养液稀释成工作细胞液(10‘个细胞/mL)，备用。7中和试验7.1对照设立7.1.1细胞对照:设4孔正常细胞对照，每孔加工作细胞液50pL、细胞维持液100pL,7.1.2强阳性血清对照:将已知滴度的标准强阳性血清用细胞维持液在96孔微量培养板上从1:4开始做倍比系列稀释，每个稀释度作5个孔(50pL/孔),4孔加100TCID;o/50pL病毒悬液50pL，微量振荡器振荡混匀，置5%二氧化碳培养箱37℃中和Ih，再加人工作细胞液50kL/孔。余下的一孔作为7.

7、1.6所描述的血清毒性对照，7.1.3弱阳性血清对照:将已知滴度的标准弱阳性血清用细胞维持液在96孔微量培养板上从1，4开始做倍比系列稀释，每个稀释度作5个孔(50pL/孔),4孔加100TCID;a/50KL病毒悬液50pL，微量振荡器振荡混匀，置5%二氧化碳培养箱37℃中和1h，再加人工作细胞液50PL/孔。余下的一孔作为7.1.6所描述的血清毒性对照。7.1.4阴性血清对照:设5孔阴性血清对照4孔加阴性血清和100TCID5o/501}L病毒悬液各50pL,再加人工作细胞液50pLo余下的一孔作为7.1.6所描述的血清毒性对照。

8、7.1.5病毒回归对照:将病毒稀释为1000TCIDso/50I.L,100TCID;o/50yL,10TCIDso/50tL,1TCIDso/50pL，每个稀释度作4孔，每孔加人病毒悬液50KL，再加人工作细胞液50K