NYT543-2002牛流行热微量中和试验方法.pdf

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1、ICS11.220B41中华人民共和国农业行业标准NY/T543-2002牛流行热微量中和试验方法Micro-neutralizationtestforbovineephemeralfever2002一08一27发布2002门2一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T543-2002前言牛流行热(简称BEF)又称牛暂时热、三日热、一日热、僵硬病等，本病在亚、非和大洋洲许多国家均有发生。该病是由弹状病毒科暂时热病毒属牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病，呈周期性流行。在发病期间，对牛的产奶量、使役能力、增重、精液品质都有严重影响，还可导致少数病牛瘫痪，流产甚至死亡。严重危害养牛

2、业的发展。本标准是根据我国科研成果，与澳大利亚合作研究成果和我国的实践经验制定的。本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人:{亘}--、严隽端。NY/T543-2002牛流行热微量中和试验方法1范围本标准规定了牛流行热微量血清中和试验技术。本标准适用于牛流行热的诊断、免疫监测和流行病学调查。2微t血清中和试验2.1器材2.1.1营养液和。.0500胰酶EDTA(简称ATV)液，配制方法见附录Ao2.1.2细胞及其制备、传代

3、、计数方法，见附录Bo2.1.3抗原(指示毒)、标准阳性血清、阴性血清由法定单位提供，按说明书使用。抗原毒价以及工作抗原(100TCID,)测定方法见附录Co2.1.4微量滴定板:无菌带盖96孔微量滴定板(简称微量板)。2.1.5微量加样器:25pL,50pL及100IL单道和多道加样器，加样塑料滴头(装量为25IpL-100pL，与加样器配套使用)。2门.6二氧化碳培养箱。2.2操作方法2.2.1灭活被检血清以及阴、阳性血清用前均于56'C水浴锅中灭活30min.2.2.2准备制备工作抗原(指示毒)方法(见第C.1章)，将已知毒价的合格种毒用生长液(见第A.1章)稀释成100'

4、I'CID,,/ml。2.2.3定性试验2.2.3.1向微量板的每孔各加25pL生长液。2-2.3.2在第一排加被检血清，每份占2孔，每孔25IAL,混合均匀，即成2倍稀释。2-2.3.3用多道加样器从第1孔取25IL液体对应移人第2排孔内，混匀即成4倍稀释。再从孔内吸出25pl丢弃。2.2-3.4每孔加工作抗原25IA，混匀置37`C孵育60min,2.2-3.5每孔加细胞悬液100pL(30000个细胞)。细胞计数方法见第B.3章22.3.6试验对照系统的设置。每批试验的对照系统的设置:标准阳性血清，从第1列至第6列，每列4孔，逐列稀释(即2倍一64倍)，标准阴性血清、细胞对

5、照和病毒对照各1列4孔。同时对本试验使用的工作抗原，随同试验再次进行测定。2.2.3.7用灭菌的盖子盖上微量板，置37℃二氧化碳W02)培养箱内，培养5d从第3d起逐日记录细胞病变效应(CPE)e2.2.18结果判定:标准阳性血清中和抗体价)64，标准阴性血清、病毒对照排各孔均出现CPE，工作抗原含量滴定在规定的范围之内(CPE出现的孔数与毒价查阅方法见第D.1章)，细胞对照孔正常情况下，4倍稀释的被检血清列，两孔都出现CPE时，判为阴性;仅1孔出现CPE，被判为可疑，应再重复试验一次;两孔均不产生CPE时，则被判为阳性xv/T543-20022-2.4定，试验(测定抗体滴度)2

6、.2.4门向微量板的每孔各加25p1生长液。2.2.4.2每份被检血清在微量板第1列占4孔，每孔加25川即待检血清为2倍稀释。2.2.4.3用多道加样器将2倍稀释的每份待检血清混匀后，吸取25KL对应移人第2排孔内，混匀即为4倍稀释，以此类推，直至稀释)64倍，最后一列各孔内混合血清各丢弃25讨2.2.4.4每孔各加工作抗原25川，但细胞对照不加工作抗原，置37C下孵育60min2.2-4.5每孔加100I'I细胞悬液(30000个细胞)。2.24.6盖上灭菌盖，置37C=氧化碳(C02)箱内培养5d。从第3d起逐日记录CPE.2.2-4.7对照系统各项试验内容、方法与定性试验相

7、同。2.2-4-8半数感染量的终点、中和抗体价计算和查阅方法见附录DaNY/T543-2002附录A(规范性附录)营养液和0.05胰醉EDTA配制方法A.1RPMI1640营养液的配制RPMI1640粉末10.4g无离子水或双燕馏水1000mL充分溶解后经0.22pm孔径微孔滤膜滤过除菌。细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10%加人灭活犊牛血清,100IU/mL青霉素和100pg/ml链霉素，然后用1mol/L盐酸(HCI)溶液调整pH值至7.2左右。细胞培养维持液的犊