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《耐热甜味蛋白brazzein的溶液nmr结构研究_二级结构和分子骨架》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、中国科学(C辑)第29卷第6期SCIENCEINCHINA(SeriesC)1999年12月耐热甜味蛋白brazzein的溶液NMR结构研究3———二级结构和分子骨架戴继勋①鸣②GöranHellekant③王金凤①王大成33高广华丁(中国科学院生物物理研究所,北京100101;①中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室,北京100101;②IngredientandFlavorTechnology,Pepsi2ColaCompany,Valhalla,NY10595,USA;③DepartmentofAnimalHealthandBiomedicalSciences,Univ
2、ersityofWisconsin2Madison,Madison,WI53706,USA)摘要brazzein是从非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中提取的一种甜味蛋白.在所有已知的甜味蛋白质中,brazzein的分子量最小,水溶性最好,并且具有很好的热稳定性.利用二维核磁共振(2DNMR)技术研究brazzein的溶液三维结构,完成了包括主链和侧链在内的所有质子共振峰的序列归属.brazzein的二级结构包含一段α螺旋(21～29),一段较短的310螺旋(14～17)和两股反平行β折叠(34～39,44～50),分子N端可能形成了第3
3、股β链(5～7).比较研究发现,该甜味分子骨架CSαβ与蝎毒、昆虫防卫素和植物抗菌蛋白γ2硫素的分子支架基本相同.以此为基础,讨论了这种多功能分子支架的意义,可能的甜味活性中心及其热稳定性的结构基础.关键词brazzein甜味蛋白核磁共振序列归属二级结构一般认为,大分子物质(分子量大于2500)不能刺激味觉细胞产生甜味,因而大多数蛋白质都是无味的.然而目前发现了一系列能够产生甜味的蛋白质,它们均不含糖类,包括mon2ellin1,thaumatin2,pentadin,curculin3,mabinlin4和brazzein5.普通甜味剂如蔗糖需10-1～10-3mol/L才能产生甜味
4、,而甜味蛋白只需较低的浓度(10-8mol/L),因此它们的甜味在等摩尔时是蔗糖的数万倍.甜味蛋白不仅可以作为低热量、高甜度的甜味剂替代品,而且可以作为甜味受体结构及其基因研究的天然工具.1994年从非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中分离提纯出一种高甜度的耐热甜味蛋白质并命名为brazzein5.它是由54个氨基酸残基组成的单链多肽,含有8个半胱氨酸,形成4对分子内二硫键,其相对分子量为6473,等电点为5.味觉实验表明brazzein的甜度是2%蔗糖水溶液的2000倍.与其他甜味蛋白相比,brazzein的分子量最小,水溶性最好,而且
5、其水溶液在80℃经4h的热处理仍然保持甜味5,6.1998208214收稿,1999202211收修改稿3国家重大基础研究预选项目(952预234)和中国科学院重点研究项目33联系人阐明甜味蛋白质的空间三维结构将揭示甜味产生的机理和结构基础.目前已有2种甜味蛋白monellin7和thaumatin8,9获得了高分辨率的晶体结构,然而对这2个结构的仔细比较并未发现明显的三维结构相似性,与产生甜味有关的活性区域仍然不清楚.因为brazzein的分子量最小,所以测定其三维结构将为揭示甜味蛋白的结构特征和确定活性作用位点提供更为直接的证据.材料和方法甜味蛋白brazzein的纯化和表征参见文
6、献5,6,经C8反相柱层析色谱鉴定样品纯度大于90%.将3.3mg蛋白样品溶于0.5mL溶剂,蛋白终浓度1mmol/L.溶剂为水(含10%D2O,用来锁场)或重水(纯度为99.996%).用稀释的盐酸或氘代盐酸调节pH为3.5.样品中还含有0.2mmol/LDSS(δ=0)作为化学位移内标,以及1mmol/L的NaN3以抑制细菌生长.所有谱图均在中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室的BrukerDMX600型超导核磁共振波谱仪上收集,温度为300K,二维谱图采用states2TPPI方法在相敏状态下测定.按照标准脉冲程序对水和重水样品分别收集了如下同核二维谱图:COSY/D
7、QF2COSY,E.COSY,TOCSY和NOESY.除TOCSY实验利用3～9～19梯度脉冲程序10,重水样品未作水峰抑制外,其他实验均利用预饱和法抑制水峰.二维谱图间接采样实验次数除水中COSY和NOESY实验为512次外,其余均为384次.DQF2COSY实验相循环参见文献11;水中TOCSY实验采用MLEV217程序12,自旋锁定时间为75ms;重水中TOCSY实验采用DIPSI2程序,自旋锁定时间为77ms;水中NOESY实验的混合时
