nmr方法解析蛋白质结构

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1、NMR方法解析蛋白质结构冯银刚北京核磁共振中心(http://bnmrc.pku.edu.cn)北京大学化学与分子工程学院fyg@pku.edu.cnyingangfeng@gmail.com2006.4.12蛋白质结构层次氨基酸通过肽键形成的生物高分子一级结构、二级结构、三级结构、四级结构肽键具有双键性质而不能任意旋转主链可旋转的二面角，20种常见的氨基酸残基通常NMR中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子核磁共振方法解析蛋白质溶液结构测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，

2、得到空间结构模型化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构）适用范围——分子量分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加）同核二维1H谱：<80氨基酸异核多维（二维、三维）：常规三共振（1H,15N,13C）<200氨基酸氘标记，特殊标记已报道有700氨基酸同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备常规样品浓度：毫摩尔每升500uL10kDa5毫克每样品均一没有聚合水溶液（10%重水锁场）pH

3、<7.5常用缓冲体系：Tris-HCl,磷酸盐，醋酸盐稳定性：室温下大于一周NaN3蛋白酶抑制剂主链HN侧链HN芳环HA脂肪族氨基酸侧链甲基H2ODSSDTT蛋白质的一维谱同核方法指认方法不同：2D1H-1H两种样品：H2O,D2O实验TOCSY,COSY,NOESY自旋系统指认，序列指认指纹区：HN-HA每个残基一个峰同核方法指认基于相邻序列间的NOE三共振方法—以杨树谷氧还蛋白C1为例实验之前——蛋白质基本性质杨树谷氧还蛋白C1(Grx-C1)分子量：117个氨基酸残基，12.5kDa等电点：

4、8.49同源性：~35%功能：谷胱甘肽依赖的氧化还原酶稳定、无聚合MASKQELDAALKKAKELASSAPVVVFSKTYCGYCNRVKQLLTQVGASYKVVELDELSDGSQLQSALAHWTGRGTVPNVFIGGKQIGGCDTVVEKHQRNELLPLLQDAAATAKNPAQL样品制备——分子生物学方法基因克隆：cDNA质粒载体蛋白质表达纯化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)离子交换色谱，凝胶过滤纯度：SDS-PAGE电泳上为单一条带同位素标记使用M9培养基：无机盐，葡

5、萄糖15NNH4Cl,13C葡萄糖样品~1mM蛋白质磷酸钾缓冲液，pH6.4，90%H2O/10%D2O0.01%DSS（化学位移校准）40mMDTT，0.01%NaN3，蛋白酶抑制剂数据采集谱仪Bruker500MHz,600MHz三共振探头采集用于解析一个蛋白质所需要的全部谱图时间约1~2月数据处理处理的内容：线性预测－加窗函数－充零－傅立叶变换－相位校正－基线校正在线与离线处理二维谱：每个约几兆三维谱：每个几十兆到几百兆nmrPipe多维谱的处理：每一维都要分别进行傅立叶变换化学位移校准重要

6、性1H使用DSS(2,2-dimethylsilapentane-5-sulfonicacidsodiumsalt)异核：间接校准以DSS的0ppm处的频率乘以换算因子得到异核的0ppm的频率NMR初步鉴定蛋白质折叠程度H2ODSSDTTNMR初步鉴定1H-15NHSQC分散程度：折叠程度确定谱宽指认基础：每个氨基酸（除脯氨酸外）都在HSQC上有一个峰三维实验（双共振、三共振）减少谱峰堆积利用异核之间较大的耦合常数基于J耦合进行共振指认，减少对空间构象的依赖三维实验绝大多数异核多维实验可以类比于二

7、维COSY,TOCSY,NOESY及其组合主链指认实验侧链指认实验NOE实验123HN---NH---Ca(i,i-1)HNCaNH化学位移指认化学位移：每个原子的身份证主链指认序列连接氨基酸类型判断主链指认HNCACB-CBCA(CO)NH化学位移指认侧链指认3DTOCSY或COSYH(C)CH-TOCSY芳环(HB)CB(CGCD)HD(HB)CB(CGCDCE)HE通过NOE确认指认主链侧链用于Grx-C1指认的实验主链指认：2D1H-15NHSQC,3DHNCA,HNCACB,CBCA(

8、CO)NH,HNCO,HN(CA)CO~10天侧链指认：2D1H-13CHSQC,3DHBHA(CBCA)(CO)NH,(H)C(CO)NH,H(C)(CO)NH,1H-15NTOCSY-HSQCHCCH-TOCSY,CCH-TOCSY,HCCH-COSY,CCH-COSY,2D(HB)CB(CGCD)HD,(HB)CB(CGCDCE)HE~20天NOE：3D15NNOESY-HSQC,13CNOESY-HSQC(foraliphaticregion),13CNOESY-HSQC(