药品微生物限度检查方法验证步骤及示教

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1、药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。2.确定供试液制备方法3.方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4.验证试验：选

2、择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5.据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。6.写出验证资料。8示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一.新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36

3、±1℃培养16-18小时。2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容8基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1

4、-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。二.菌液稀释计数方法细菌：大肠、金葡、枯草、铜绿稀释：营养肉汤作为稀释剂,按10-2、10-4、10-5、10-6稀释级10-2：取新鲜浓菌液0.1ml→9.9ml充分打匀、10-4：取10-20.1ml→9.9ml充分打匀10-5：取10-41ml→9ml充分打匀，取0.2ml×2皿营养琼脂计数10-6：取10-51ml→9ml充分打匀取0.2ml×2皿营养琼脂计数生孢梭菌（厌氧梭菌）：硫乙醇酸盐流体培养基为稀释剂按上述步骤稀释至10-7。10-5、10-6、10-7、分别用50ml硫乙醇酸盐流体培养基计数，各1-2支。

5、细菌计数：36±1℃培养24小时计数菌落数。白色念珠菌：0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释至10-5、10-6计数。黑曲霉浓菌悬液：0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释10-4、10-5、10-6计数。25-28℃培养24-36小时计数菌落数。操作要点：1.新鲜浓菌液制备：挑取的菌落充分研匀并摇匀8，注意各菌培养时间；2.稀释菌液时每一步均应充分摇匀；3.枯草芽孢杆菌新鲜浓菌液会形成膜或沉淀，稀释菌液时必须充分振摇后静置，取其无块状物的菌液；4.黑曲霉接种时注意不能造成对接种环境的污染；点计菌落数时轻拿轻放以免造成计数误差。11.5下午三.微生物限度检查方法选择

6、预试验根据样品的溶解性、药效、可能存在的抑菌性等确定预试验方法。计数（细菌、霉菌及酵母菌）验证一般选择顺序：平皿法、平皿稀释法、中和法+平皿稀释法、薄膜过滤法、离心500r/min3-5分钟上清液+平皿稀释法（细菌）、沉降+平皿稀释法（霉菌），离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）+平皿稀释法、离心500r/min3-5分钟上清液+薄膜过滤法（主要用于细菌计数验证）。方法应在符合验证要求的前提下，考虑简便可行。样品：感冒清热颗粒方法：平皿稀释法示教1.供试液制备方法：样品10g+稀释剂90ml为1：10供试液。（最低稀释级作为验证供试溶液）。2.计数验证回收试验：试验组

7、（各1-2皿）菌液组（各2皿）、供试品对照组（各2皿）↓　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　↓1ml0.5ml0.2ml0.1ml（+大0.5ml）大0.5ml细1ml0.5ml0.2ml0.1ml1ml0.5ml0.2ml0.1ml（+金0.5ml）金0.5ml霉1ml0.5ml1ml0.5ml0.2ml0.1ml（+枯0.5ml）枯0.5ml1ml0.5ml（+白0.5ml）白0.5ml81ml0.5ml（+黑0.5ml）黑0.5ml（共55皿，按规定培养、计数菌落、计算回收率）3.根据回