分离小鼠心肌细胞protocol

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1、分离小鼠心肌细胞Protocol实验动物：小鼠,体重20~30g1急性分离心肌细胞A实验准备：1）无钙台氏液：配500mL无钙台氏液(50mL台氏母液+450mL去离子水+1g葡萄糖),用NAOH调PH，一般在7.35~7.4之间即可，注：充氧后调PH值，否则充氧后PH下调。调PH值前严格校正PH计，小鼠心肌细胞对PH值特别敏感。表1：台式母液配方mMMWg/Lg/500ml(10x)NaCl12658.447.36336.82KCl5.474.550.4032.02Hepes10238.32.38311.

2、92MgCl2.6H2O1.0203.30.2031.02NaH2PO4.2H200.33156.010.0520.2574CaCl21.8147.03Glucose10198.2注：CaCl2,Glucose配制时后加，（浓度0.9MCaCl2母液6.616g(有水)或者4.995g(无水)+50ml去离子水），0.2mlCaCl2母液/100ml无钙台氏液2）称取5mg胶原酶Ⅱ+8mg白蛋白3）配有钙液200ml：即200ml无钙液+0.4mlCaCl2(0.9M)。注：小鼠心肌细胞对钙浓度特别敏感，我

3、们为了缩短心脏复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙离子浓度降到正常的浓度的1/44)准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直镊子两把，止血钳两把，弯镊子两把，纱布一块，注射器60mL一个，10mL一个；手术线一团(小鼠主动脉比较细，手术线比大鼠的要细)；表面皿三个，小烧杯50mL三个，量筒50mL两个，500mL一个；大烧杯500mL一个250mL一个；滤纸若干！滴管4个,7号注射针头一个（尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系线）。5）KB液配方mMMWg/LGlutamica

4、cid(谷氨酸)70147.1310.3Taurine(牛黄酸)15125.141.875KCl3074.552.237Hepes10238.32.383MgCl2.6H2O0.5203.30.1015Glucuse10198.21.982EGTA0.5380.40.19KH2PO410136.091.36注：5MKOH调PH值（7.3-7.4），5MKOH配制：28gKOH溶于100ML去离子水，KB液保存在-20℃冰箱中保存。B实验过程1）、实验前准备：（1）、准备仪器：电热恒温器（带水泵的）、Lang

5、endorff灌流系统。（2）、检查氧气瓶里是否有氧气。（3）、打开恒温灌流装置的电源开关，调节电热恒温器的水温，泵出的水打入冷凝管，使通过冷凝管的灌流液保持37℃的恒温。（4）、清洁Langendorff管路，第一次使用先泡酸后用蒸馏水冲洗干净，以后每次使用前先用去离子水将Langendorff管冲洗3遍即可开始实验。（5）、配制好无钙的细胞外液及有钙液，并取约50ml有钙液置于表面皿中后放置在冰袋上，使其温度降到0℃左右；另一50ml有钙液置于表面皿中放入4℃冰箱待用（6）、向冲洗后的Langendor

6、ff管中加入有钙液，用注射器轻轻吸出气泡，并向管中通入氧气。有钙液浓度降到正常浓度的1/4，灌入大概50ml有钙液，上面倒无钙液。（7）、分别称取5mg胶原酶和8mg白蛋白，用约50ml无钙液溶解、备用。（8）、10ml注射器连接预备好的7号针头，手术线打松结待用。2）、正式试验：（1）、选取小鼠，称重，用1%戊巴比妥麻醉(腹腔注射），麻醉剂剂量尽量小，如果无需监测心电可采用断髓法处死小鼠。不必打肝素，肝素抗凝同时对心脏也用副作用。（2）、待麻醉充分后，迅速开胸取出心脏（取心脏时切忌用手碰到心脏，首先用小直

7、剪刀靠近头段剪断主动脉，用另一只手持直镊子提起肺组织，从下方游离心脏），放到0℃的有钙液中洗涤（可以轻轻的用食指按压心脏，使心脏内的血液蹦出来，同时观察蹦出来的动脉孔，即主动脉），分离出主动脉（主动脉不能分离太长，同时去除心包膜，即周围的组织，动作要迅速，主动脉一般位于两个白色胸腺下方，主动脉上端可见其三个分支，沿分支处剪断主动脉，暴露主动脉干出口），用预备好的连在10ml注射器的7号针头轻轻插入主动脉，用手术线固定主动脉（使灌流针头在主动脉的根部即可，太向下或者太向上灌流效果都不好，一般在肺动脉圆锥上端）

8、，将Langendorff管上三通打开，液体流出，然后把固定心脏的7号针头连接到Langendorff管上，用有钙液灌流，同时观察肺动脉流出道是否被堵住，如果堵住立即用小剪刀剪开（同时观察液体流下的速度，调节灌流针的深度）待心脏跳动几次后，加入无钙液，直至心脏停止跳动（完全停止，否则影响酶的消化，同时用拇指和食指轻轻挤压心脏感觉硬度），无钙液灌流时间稍微长一点比较好，停跳后10~20分钟加入预先配好的胶原酶和白蛋