高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及基因型鉴定-农业昆虫与害虫防治专业论文

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1、优秀毕业论文河北农业大学硕士学位论文高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及基因姓名：程林友申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：李国勋;王勤英20040618精品参考文献资料优秀毕业论文摘要苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis简称Bt)是目前研究最深入、使用最广泛的杀虫微生物之一，但甜菜夜蛾对目前已发现的绝大多数Bt菌株不敏感或低敏感，已商业化的苏云金杆菌杀虫剂对其效率很低。由于甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHubner)近些年来在我国大面积频繁爆发、猖獗成灾，因此深入发

2、掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源，筛选高毒力及特异性菌株，对其基因型进行分析，其结果对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物都具有重要的理论及实践意义。本研究从河北省境内55个县市采集土样700份，采用醋酸钠一抗生素分离法从中分离出苏云金芽孢杆菌34株，对田间采集的自然死亡的虫尸采用平板稀释法分离到Bt菌株13株。以甜菜夜蛾、棉铃虫(Helicoverpaat·migeraHubner)、粘虫(MythimnaseparataWalker)、玉米螟(Ostr／n缸furnacalis(H

3、ubner))和小菜蛾(Plutellsxylostella(Linnaeus))的一龄幼虫为试虫进行生物测定，从中筛选出11株对鳞翅目幼虫具有高毒力的Bt菌株。经复筛确定T4—3和CYZ一13两株对甜菜夜蛾活性最好，且这两株对鳞翅目幼虫表现出广谱性。以HD．1为标准菌株测定了两株发酵液的致死中浓度(LC50)分别为2．01X100cells／mL(T4．3)、1．50×106cells／mL(CYZ-13)和5．76×106cells／mL(HD．1)，结果表明两株的毒力高于HD，12—3倍。随后对两菌株进

4、行了vP反应、水解电泳、蔗糖产酸、菌膜、纤维二糖产酸、甘露糖、水解七叶灵、解朊反应、脲酶产酸和卵磷酯酶产生lO项生化反应指标测定，结果表明Bt．T4—3的所有指标同B．t．subsp．subtoxicus一致。BtCYZ一13同Bt．subsp．kurstaki一致。用GT培养基发酵培养，以HD一1为标准菌株测定T4—3和CYZ一13的生长曲线表明三种菌株生长曲线及三种时期差异不显著，这两种菌株的实际发酵应用中不用特殊处理。利用PCR—RFLP体系合成四对引物KSun2／K3un2，K5un3／K3un3，S

5、5un2／S3un2，S5uni／S3uni，以T4-3和CYZ-13两菌株的质粒提取物为模板对四对引物进行PCR扩增，并分别采用限制性内切酶PstI／Xbal，EcoRI／PstI，MspI／MvaI和Bspll9I／BanI对四对引物的PCR产物进行双酶切，鉴定两菌株的基因型。结果表明T4-3含有crylAa、crylAc、cryMg、cry2Ac、cryllal基因。CYZ—13含有cryMc、cryBc、cry2Ab基因。琼脂糖凝胶电泳图谱显示，CYZ．13菌株的CrylAc基因酶切图谱不同于标准图谱

6、，初步推断为新基因。此外还以东亚飞蝗初孵若虫为试虫对21株Bt菌株进行筛选，得到两株对东亚飞蝗较高毒力的特异菌株uVll7和wY．17，校正死亡率达70％以上。关键词苏云金杆菌；PCR．RFLP：Bt．CYZ．13：Bt．T4．3；生物测定精品参考文献资料优秀毕业论文SeeeningofNewBacilludsthuringiensisstrainswithHighInsecticidalActivityandGene—typesIdentificationPostgraduate：ChenglinyouMa

7、jor：AgricultureinsectandpestcontrolAdvisor：LiGuoxunBacillusthuringiensis(Bt)isazpore—forminggram-positivebacterium．Duringsporulation，theintracellularinsecticidalcrystalproteins(Cryproteins)areproducedasphase．brightinclusions．Theseproteinsaretoxictoinsectlar

8、vaeintheOrdersLepidoptera．Diptera,andCo]eoptera．TheCryproteinfromBthasbeendevelopedasoneofthemostsuccessfulbiologicalagentsinindustrytocontr01insectpests．ToobtalnnovelBtstrairlsforproductionofCryprotei