酒精发酵实验方案

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1、酒精发酵实验一、实验目的1.掌握酵母菌的筛选方法2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤3.掌握酵母生产性能的测定：酵母凝聚性的测定、酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、4.掌握用DNS法测定还原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力5.学习酒精出酒率的计算二、实验器材1．实验器材恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电磁炉，水浴锅，微波炉，移液枪，枪头，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，连通器，天平，酒精计，超净工作台，摇床，试管，紫外分光光度仪，培养皿，玻璃棒，涂布棒，离心管，离心机，

2、漏斗，滤纸，玻璃珠，pH试纸2．试剂及药品碘液，20%盐酸溶液，20%氢氧化钠溶液，500μg/ml标准葡萄糖溶液，玉米粉，糖化酶，马铃薯，酒糟，无水乙醇，蒸馏水，DNS试剂，可溶性淀粉，葡萄糖3．实验材料番茄4．实验培养基PDA马铃薯200g蔗糖（或葡糖糖）20g琼脂15-20g水1000mlPH自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，用纱布过滤，在加糖和琼脂，定容至1000ml。121℃灭菌30min。DNS试剂酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03

3、g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml三、发酵工艺（技术路线）番茄破碎一驯化培养一平板涂布分离—纯化—酵母菌株的筛选—生产性能鉴定一优良酵母获得。四、实验步骤（一）酵母菌种的驯化筛选1.酵母菌种的筛选分离采用平板涂布法和划线法。将榨取的番茄汁稀释到10-3、10-4、10-5后在PDA培养基平板上涂布，后置于28℃隔水式恒温培养箱中静止培养3d；从分离得到的酵母菌落中挑取一环酵母菌在PDA平板上划线，后置于28℃隔水式恒温培养箱中静止培养2d。2.酒精发酵液的微生物检

4、查1）酵母形态的观察用美蓝染色法取对数生长期的菌体进行制片，在放大10倍及40倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。具体步骤如下：①在载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在发酵液上培养了48小时的啤酒酵母少许，放在美蓝染色液中，是菌体与染色液均匀混合。②取盖玻片一块，小心地盖在液滴上，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。③将制好的水浸片先用低倍

5、镜观察，然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞，因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，所以细胞内氧化还原值(rH)颇小，而还原力强，若有无毒的染料进入细胞，即被还原脱色，但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。美蓝无毒，且能为活细胞还原成无色，故可用以区别细胞的死活。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。可以选择已知酵母菌进行对比。酵母菌是单细胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球形、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种形状。酵母

6、菌是通过芽殖进行繁殖，因此有时可以观察到带有芽的菌株。（二）测定指标及其方法1.酵母生产性能鉴定(1)酵母菌产酒精能力（发酵力）的测定本实验主要采取称重法与测放出的CO2量等测定酵母的发酵力。称重法:我们将不同酵母菌产酒精能力的测定和酒精发酵合在一起。1.材料:①玉米粉②1000ml的烧杯③灭菌的250ml的三角瓶④培养24h的酵母液⑤电子天平⑥无菌水和玻璃珠若干⑦微波炉⑧1ml移液枪和枪头⑨玻璃棒⑩水浴锅2.操作：①糊化：将625mL水加到糖化锅中，按照料水比1：5称取玉米粉125g，在电炉上加热并搅拌

7、，调节pH5.5～6.0，观察现象，记录下黏度迅速增加时的温度。②糖化：待醪液冷却到60℃，调节pH值至4.0－4.5，用移液枪（按0.6～0.8%/g淀粉）量取糖化酶加入糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅中，保持温度为60℃，维持约10h，用碘液测定糖化液是否含还有淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面降低。③糖化结束后将糖液pH值调至5.0左右。④取一些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量（用DNS法测定）。⑤将糖化好的糖化液分装5个250毫升的三角瓶（每个

8、约150毫升），接种培养24小时的酵母菌，接种量为发酵液的10%（约15毫升）。⑥用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将发酵液放于28-30℃的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。(2)酵母菌耐酒精能力的测定：将产酒精能力最强的菌体用去离子水洗涤2次，后于30℃和不同的酒精浓度（0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%）条件下进行试验，定期取样检测活细胞目：菌体的耐酒精能力以酵母细胞增