光 合 关 键 酶 的 测 定 方 法

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1、光合关键酶的测定方法一、酶液的制备取植物样品0.5g左右放入用液氮预冷的研钵中，迅速研磨成粉末状，加入3.0ml（w/v为1：6）预冷的100mMTris-H2SO4提取缓冲液【PH8.2，内含7.0mM巯基乙醇，1.0mMEDTA-Na（乙二胺四乙酸钠盐），5%甘油和1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）】，混匀后在4℃下反应20min，混合液于4℃下15000r/min离心15min，取上清液备用。二、RUBPC活性的测定方法（参照Racker方法并略加改动）反应混合液（总体积3.2ml）组成：0.1MTris

2、-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1MMgCl2、50mM腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、50mM二硫苏糖醇（DTT）、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml，200µMNaHCO30.1ml，蒸馏水1.0ml，3-磷酸甘油酸激酶（PGK）/3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAP-DH）（15u/15u）0.1ml，酶提取液0.1ml，30℃恒温水浴预温10min，将反应体系摇匀倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，于340nm下测吸光度值E0，最后加入9.0mM1，5-二磷酸核酮糖（RuBP）0.1ml启动

3、反应，立刻每隔10～15s间隔测定光吸收的变化。三、PEPC活性的测定方法（施教耐等方法）反应液总体积3.1ml，内含1.0ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2)，1.0ml酶提取缓冲液，0.1ml10mMMgCl2，0.1ml10mMNaHCO3，0.2ml40mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），0.3ml1.0mg/mlNADH，过量的苹果酸脱氢酶（MDH，约10.5U）0.2ml，于28℃水浴预温10min，用0.2mlPEPC提取液启动反应，迅速在340nm下测吸光度的下降。RuBPCaser

4、eactionmedium1.0.1MTris-HCl(pH8.0)2.0.1MMgCl23.50mMATP4.50mMDTT各0.3ml5.2mMNADH6.1mMEDTA7.200µMNaHCO30.1ml8.PGK/GAP-DH（15U/15U）0.1ml9.9mMRuBP0.1ml10.酶提取液0.1ml11.蒸馏水1.0ml总体积3.2mlPEPCasereactionmedium1.0.1MTris-H2SO4(pH9.2)1.0ml2.酶提取缓冲液1.0ml3.10mMMgCl20.1ml4

5、.10mMNaHCO30.1ml5.40mMPEP0.2ml6.1mg/mlNADH0.3ml7.过量的MDH（约10.5U）0.2ml8.酶提取液0.2ml总体积3.1ml酶活性测定反应液组成：注：参考文献――董永华等，ABA和6-BA对水分胁迫下玉米幼苗碳素同化关键酶的影响。植物营养与肥料学报，1997，3（2）：182－187.四、RUBPC和PEPC活性测定操作步骤操作流程如下：准确称取0.5g±植物样品，剪碎放入预冷研钵中加入液氮，迅速研磨加入3.0ml提取缓冲液，4℃下反应20min溶液在4℃

6、下15000r/min离心15分钟PEPC测定RUBPC测定上清液即为粗酶液，冰箱内保存备用（4℃）RUBPC反应液2.9mlPGK/GAP-DH0.1ml(15U/15U)酶提取液0.1ml蛋白测定PEPC反应液2.5mlPEP0.2mlMDH（约10.5U）0.2ml取0.1ml粗酶液加5.0ml考马斯亮兰染色剂，混匀放置2.0min，于595nm比色30℃水浴10min340nm测光密度E028℃水浴10min加酶提取液0.2ml启动反应，迅速在340nm测吸光度的下降（3min）加RUBP0.1m

7、l启动反应，迅速检测吸光度的减少（1min）说明：1.RUBPC反应液（2.9ml）包括：0.1MTris-HCl(pH8.0)、0.1MMgCl2、50mMATP、50mMDTT、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml，200µMNaHCO30.1ml，蒸馏水1.0ml。2.PEPC反应液（2.5ml）包括：1.0ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2)，1.0ml酶提取缓冲液，0.1ml10mMMgCl2，0.1ml10mMNaHCO3，0.3ml1.0mg/mlNADH。3.

8、上述两种反应液的配制方法是：先按要求的浓度配制各组分试剂溶液，然后根据各试剂的体积按比例混合而成。4.为减小实验误差，粗酶液提取出来后，应先测RUBPC活性，其次测PEPC活性，最后测定可溶性蛋白含量。可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇(用无水乙醇加水兑成)中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。(配制时要避光)(1000ml反应液可做330个样品)测定：20ūl酶液+3mlG