多重聚合酶链反应技术快速检测志贺菌、副溶血性弧菌

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1、多重聚合酶链反应技术快速检测志贺菌、副溶血性弧菌志贺菌属是一类革兰阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐弧菌，为食物中毒中常见的一种革兰阴性弧菌。检测这2种细菌，传统的方法主要依赖培养，耗时长，一般需3~7d[1]。�随着医学分子微生物学的不断发展，近几年研制出的单一聚合酶链反应(PCR)技术检测病原体的方法，已在许多临床实验室中开展，并显示出了较突出的优点，但仍摆脱不了检测1种病原菌，需要1种器皿的模式，还达不到简单的目的。为此，我们在研究单一PCR方法的基础上，又建立了多重PCR快速检测志贺菌

2、和副溶血性弧菌的新方法，在同一反应管内，用两对不同的引物同时检测2种病原菌的存在[2]。��1材料与方法�1.1菌种�志贺菌不同血清型菌株10株，副溶血性弧菌10株，由上海市疾病预防控制中心提供部分标准菌株，其余均为本实验室鉴定保存菌种。�1.2仪器�TechneFlexigenePCR扩增仪;TanonGIS-2010全自动数码凝胶成像系统。� 71.3引物设计�检测志贺菌的引物:�上游:5’tccggagattgttccatgtg3’;下游:5’tgtatcacagatatggcatgc3’。�检测副溶血性弧菌的引物:�上游:5’at

3、tctgctgtgttcgtaaaat3’;下游:5’ccaagtaaaatgtatttggatg3’。�所有引物及试剂均由上海第二医科大学天能科技有限公司合成和提供。�1.4PCR模板制备�参照文献[2]，取3~4个菌落，悬于100μL蒸馏水中，95℃水浴15min，放冰浴冷却，再10000r/min离心20s，取上清液(DNA含量约30~50ng/μL)放-20℃备用。�1.5PCR反应�采用标准PCR反应液的配制方法[3]，我们将各引物对分别配成单一PCR系统。在使用TaKaRaLATaq酶(DRR02AM)时，加入10×LAPCR

4、Buffer(Mg2+free)5μL，dNTPMixture(各2.5mM)8μL，MgCl2(25mM)5μL。Primer1:0.2~1.0μM，primer2:0.2~1.0μM，TaKaRaLATaq酶(5U/L)0.5μL，加灭菌蒸馏水定容至50μL。PCR反应条件为:94℃预变性5min，94℃40s，55℃35s，72℃90s循环35次，72℃延长37min。经Agarose凝胶电泳紫外灯下观察结果。1.6特异性试验�从两组单一PCR系统中各取出不同量反应液按一定比例混合后加入志贺菌､副溶血性弧菌ᦊ

5、0;鼠伤寒沙门菌､大肠埃希菌的DNA模板，制成总量50μL体系的多种组合，进行多重PCR扩增。�1.7敏感度试验�利用目测比浊法将志贺菌和副溶血性弧菌在108处开始作10倍递减稀释，从10-1~10-8稀释度中各取1mL作PCR扩增。并同时作平板菌落计数。�1.8引物的浓度配伍�将两对引物配制成几组不同的浓度，志贺菌引物∶副溶血性弧菌引物为1∶1､1.5∶1､3∶1､4∶1､1∶1.5､1∶3､1∶4。在相同的反应条件下，先用单一PCR扩增体

6、系扩增出阳性标本，然后用上述几组不同浓度比的多重PCR引物体系进行扩增，选出引物最佳浓度配伍。��2结果�2.1引物特异性和敏感度�各对引物只与对应的菌种发生阳性扩增，志贺菌阳性条带为420bp，副溶血性弧菌阳性条带为290bp，与其他菌株均未出现特征性阳性条带(图1)。� 7引物的敏感度实验结果，志贺菌和副溶血性弧菌引物均可检测到10~20cfu/mL菌量水平。��1.Marker(100bp);2.志贺菌+副溶血性弧菌;3.志贺菌+副溶血性弧菌+鼠伤寒沙门菌+大肠埃希菌;4.志贺菌+鼠伤寒沙门菌+大肠埃希菌;5.副溶血性弧菌+鼠伤寒沙

7、门菌+大肠埃希菌�图1引物的特异性2.2引物的浓度配伍�在本实验室条件下，引物志贺菌∶副溶血性弧菌浓度比为�3∶1。�2.3常规培养法､单一PCR与多重PCR检测实际样品的比较�对采集的336份食物中毒事件样品检测副溶血性弧菌，其阳性检出率为31.25%~35.41%。�常规法和单一PCR法､复合PCR法检测副溶血性弧菌的阳性符合率均为88.24%。单一PCR法和多重PCR法的阳性符合率为100.00%(表1)。��对医院肠道门诊采集的220份肛拭样品检测志贺菌，其阳性检出率为19.55%~23.18%。�常规

8、法和单一PCR法､多重PCR法检测志贺菌的阳性符合率分别为�84.31%､86.00%。单一PCR法和多重PCR法的阳性符合率为98.04%(表2)。�� 73讨论