副溶血性弧菌流行群特异多重pcr鉴定论文

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1、副溶血性弧菌流行群特异多重PCR鉴定论文【摘要】目的建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌流行群的特异多重PCR方法。方法查找副溶血性弧菌的基因序列，将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较，设计针对流行群的PCR引物，并进行多重PCR扩增。结果运用群特异多重PCR法可特异性的扩增出当前流行群副溶血性弧菌的目的基因片段，可大大缩短鉴定时间。结论群特异多重PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群，有利于流行病学溯源等。【关键词】副溶血性弧菌副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐性细

2、菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起食源性感染，导致急性胃肠炎〔1〕。副溶血性弧菌可分为13个O血清型和71个K血清型〔2〕，当前流行的副溶血性弧菌以O3:K6、O4:K68和部分O1血清型为主。研究显示.freelin，10000r/min离心5min，取上清作为DNA模板。14多重PCR扩增目的基因和扩增条件优化分别采用单一引物对扩增相应目的基因片段，进行PCR扩增条件的摸索，接着进行多重PCR扩增条件的筛选和优化。最后采用的多重PCR扩增条件是50μl的PCR反应体系中含10PCR反应缓冲液50μl，25mmol

3、MgCl230μl，10mmoldNTP10μl，tdh上游引物（25pmol/μl）10μl，tdh下游引物（25pmol/μl）10μl，toxRS/neol/μl）10μl，toxRS/neol/μl）10μl，模板DNA50μl，Taq酶（5U/μl）06μl，灭菌双蒸水补足至总体积50μl。将PCR反应体系置于PCR热循环仪上，94℃5min；94℃30s，45℃30s，72℃60s共30个循环。最后，72℃延伸10min。15电泳检测取5μlPCR产物和1μl6×上样缓冲液充分混匀置20％琼脂糖

4、凝胶〔含溴化乙锭（EB）05mg/L〕电泳。电压5v/cm,电流40mA，电泳缓冲液05×三乙基硼烷（TBE）。凝胶成像仪观察结果并拍照。16敏感性试验从TCBS培养基37℃培养18～24h的副溶血性弧菌中刮取菌落用灭菌双蒸水配成菌悬液,活菌系列稀释菌落计数后,再以灭菌双蒸水对副溶血性弧菌菌株进行10－3～10－8cfu/ml的稀释,从各稀释度中取100μl做PCR，进行敏感性评价。2结果21单一引物PCR扩增（图1、图2）tdh基因片段引物能扩增出11株流行群副溶血性弧菌，产物大小约为360bp左右，在图1中，1～1

5、1泳道为流行群副溶血性弧菌，有目的条带。而在同一条件下扩增的大肠埃希菌、金黄色葡萄菌均未扩增出目的片段，图1中12和13泳道分别是大肠埃希菌和金葡菌，均未见目的条带；toxRS/nearker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11:O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌图1细菌tdh基因片段的扩增（略）M：100bpmarker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11:O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；

6、13：金黄色葡萄球菌图2细菌toxRS/nearker；1～7：O3:K6型副溶血性弧菌；8～9：O4:K68型副溶血性弧菌；10～11:O1:K25型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌图3细菌tdh和toxRS/neePCR)、脉冲场电泳〔8〕(PFGE)、基因芯片〔9〕等。APPCR容易引起非特异性扩增，而实时PCR、PFGE和基因芯片方法技术含量高并且设备价格昂贵，因此，均不适于基层单位开展工作。由于当前的副溶血性弧菌食源性感染以流行群为主，并且可致病的多为含有耐热直接溶血素，因此，针对流行群特异的to

7、xRS/neeMartinez-Urtaza,AntonioLozano-Leon,AngeloDePaola,etal.Characterizationofpathogenicvibrioparahaemolyticusisolatesfromclinicalsourcesinspainandparisonericanpandemicisolates［J］.JClinMicrobio,.freelentofevolutionofpandemicvibrioparahaemolyticusbymultilocussequenc

8、etyping［J］.JClinMicrobio,2004,42(3):1280-1282.〔3〕TracieLMusser,JessicaLNordstrom,etal.Identificationofaproteinbiomarkeruniquetothepandemic