厚、薄血膜法查疟原虫

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1、厚、薄血膜法查疟原虫基本原理：疟原虫寄生于红细胞，经制片、染色后，显微镜下可以鉴别疟原虫的虫种和虫期。试剂器材：75%酒精棉球、采血针、载玻片、甲醇、pH7.0~7.2PBS缓冲液、姬氏染液（或瑞氏染液）、显微镜等。操作方法：  (1)采血：①采血时间 在普查时，一般无法考虑采血时间。在临床上，对现症病人一般可随时采血，但为了提高检出率，就应当考虑采血的适当时间。对典型发作的间日疟及三日疟患者，应选择发作后数小时至10余小时采血为好。此时疟原虫发育至环状体乃至大滋养体，虫体大，疟色素已形成，受染红细胞也出现变化，有利于疟原虫的检出。恶性疟原虫大滋养体和裂殖体是在皮下、脂肪

2、和内脏微血管中发育的，通常在外周血液中不易查到，配子体在环状体出现1周后方能见于外周血液，故在发作时采血。②采血部位 从患者耳垂或指尖（以左手无名指为宜）取血，婴儿通常从大姆趾第二趾骨腹面针刺采血。③采血方法 用75%乙醇棉球消毒取血部位皮肤，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，右手持针迅速刺入皮肤，待血液流出或轻轻挤出血滴，供制作涂片用，采血完毕用干棉球轻压伤口止血。(2)制片：①薄血膜的制作 取1滴血于1张洁净的载玻片上，选1张边缘平整、光滑的载玻片作推片，用左手拇指和中指夹持其两端，将推片的边缘中点与血滴接触，并与载玻片呈30o~45o夹角，待血滴沿推片边缘向两侧展

3、开后，立即由右向左迅速推成薄血膜。理想的薄血膜要求红细胞均匀地铺成一层，无裂痕，其末端凸出呈舌尖形。注意：推片时用力和速度要均匀，不能中途停顿或重复推片，以免造成血膜断裂或厚薄不匀。如取血量多，夹角宜小；取血量小，则夹角可大些。②厚血膜的制作 用推片的一角接触刺血点上的血滴，取血2滴，置载玻片上，并从里向外作旋转涂布，使成直径为0.8cm大小的圆形血膜，厚薄要均匀，然后平置桌上，待自然干燥。③厚薄血膜同片制作 用目测法将载玻片从右到左等分成6格，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部，第1、2格可用于贴标签，制作厚、薄血膜方法同上。(3)染色：①瑞氏染色法

4、（Wright’staining） 厚血膜需先溶血，溶血方法为：滴加数滴蒸馏水于厚血膜上，使红细胞溶解，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。取制作好的血片，在血膜两端用玻璃蜡笔各划一竖线，滴加瑞氏染液数滴，使其布满血膜，染液中含甲醇，约0.5~1分钟将血膜固定，然后加等量缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使之与染液混匀，很快液面出现灿铜色膜，约经3~5分钟染色后，用缓冲液、蒸馏水或自来水冲洗。注意：切勿倾去染液再用水冲洗，以免血膜上沉着染料颗粒，影响镜检。如厚、薄血膜涂在同一张载玻片上，先在厚、薄血膜中间及两侧用蜡笔各划一条竖线，滴蒸馏水于厚血膜上，使之溶血，待血膜干后，与薄血膜

5、一起染色。①吉氏染色法（Giemsa’staining） 取吉氏染液原液，用pH7.0~7.2的磷酸缓冲液稀释10~20倍。厚血膜不需固定，薄血膜先用甲醇固定（如厚血膜在同一张载玻片上，切勿延及厚血膜），干后滴加稀释的吉氏染液，布满血膜（如大批染片，可置入染色缸），染20~30分钟，冲洗，晾干后镜检。稀释的染液，宜用时现配，否则易产生沉淀，影响染色效果，大批染片时，应根据染色时的条件，如不同病人的血片，染色时的室温、染液稀释程度、冲洗水的pH值等情况的不同，先试染少量血片，摸索出染色效果最佳的时间和条件，再大批染片。此外，染色时间应随染液稀释情况作适当的调整，染液浓度高，

6、染色时间可短些，反之则长。吉氏染液配制：吉氏染剂粉1g，甘油50ml，甲醇50ml。将染剂粉置研钵中，加少量甘油，充分研磨，再边加甘油边研磨，直至甘油用完。然后加少量甲醇，研磨后倒入棕色瓶中，剩余的甲醇分几次冲洗研钵中的染液，全部倒入瓶内，塞紧瓶塞充分摇匀，置65℃温箱内24小时或室温下1周后过滤，即成原液。瑞氏染色法操作简便、快速，临床上经常使用，因甲醇易于蒸发，如掌握不当可能在血膜上产生沉淀，妨碍观察。同时染色结果也不大一致，在较热的环境中较易褪色，保存时间较短。吉氏染色法染色效果良好，对厚血膜尤佳。经稀释后的染液对厚血膜兼有溶血和染色的双重作用。染色后，疟原虫细胞核

7、和细胞质红蓝分明，很少出现沉淀，不易褪色。适用染大批血片标本，供教学使用，但染色需时较长。(4)镜检 在检查薄血膜过程中，有时遇见与疟原虫形态类似的物体，应注意区别排除。如单个血小板附于红细胞上，易误认为环状体或成长中的滋养体。成堆的血小板误以为成熟的裂殖体。血小板的形状多样，或呈圆形，卵圆形，有时呈不规则多角形，其长径约为红细胞的1/3~1/4。血小板中央部常呈紫红色颗粒状结构，周边部分着色浅，但不如疟原虫紫红色胞核与浅蓝色胞质分得清楚。此外，还有染色液沉淀颗粒以及偶有细菌、霉菌、尘粒、白细胞碎片重叠于红细胞上，很像环状体和