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《人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆表达纯化-fdurop》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、复旦大学2011届望道学者结题报告与心得集人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆、表达、纯化、以及甲基转移活性研究化学系张思学指导教师谭相石摘要：本实验探索了一套有效的克隆、表达、纯化和体外重组具有生物活性的难辨梭状杆菌（ClostridiumDifficile）中钴铁硫蛋白的方案。钴铁硫蛋白的两个亚基CfsAcd和CfsBcd分别构建入MBPHT-mCherry2和pETDuet-1载体，在大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达。其中CfsAcd采用了MBP标签可溶性表达，CfsBcd采用了包涵体提取的方法。利用Ni-TNA柱纯化后的两个亚基再体外组装
2、钴胺素和铁硫簇[Fe4S4]。经过对重组的钴铁硫蛋白进行的ICP-AES金属含量分析、紫外可见光谱表征、和stoppedflow快速反应动力学测定，证明了所重组得的蛋白结构正确，具有甲基转移的生物活性。关键词：难辨梭状芽孢杆菌；Wood-Ljungdahl代谢通路；钴铁硫蛋白；[Fe4S4]立方簇；钴胺素；大肠杆菌异源表达；甲基转移活性AbstractThecorrinoidiron-sulfurproteinconsistsoftwosubunits,acobalamincofactor,anda[Fe4S4]cluster.Thegenesencodingsubunitγan
3、dδwererecombinedwithvectorMBPHT-mCherry2andpETDuet-1respectively.TheyareexpressedinE.coli.strainBL21-CodonPlus(DE3)-RIL.Subunitγwasobtainedbysolubleexpressionwithanmaltose-bindingprotein(MBP)fusiontag.Subunitδwasextractedfrominclusionbodies.ProteinswerepurifiedbyNi-TNAcolumnandgelfiltrationco
4、lumn.Afterreconstitutionof[Fe4S4]andcobalamin,thecorrinoidiron-sulfurproteincanbeobtained.ThecharacterizationsincludeICP-AES,UV-vis,andstoppedflowkinetics.Itcanbeprovedthatthereconstitutedcorrinoidiron-sulfurproteinhascorrectstructureandmethyltransferactivity.KeywordsClostridiumDifficile;Wood
5、-Ljungdahlpathway;Corrinoidiron-sulfurprotein;[Fe4S4]cluster;Cobalamin;E.coliexpressionsystem;Methyltransferactivity前言难辨梭状杆菌(Clostridiumdifficile)是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病因。进入21世纪以来,艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,350复旦大学2011届望道学者结题报告与心得集CDI)的发病率和疾病的严重程度在全球范围内呈上升趋势。2001年后,在北美、澳大利亚及欧洲等国家,出现
6、了C.difficile的高毒力菌株BI/NAP1/027/毒素Ⅲ型。C.difficile相关性腹泻(Clostridiumdifficile-associateddiarrhea,CDAD)的地区播散性暴发流行[1,2],常导致住院患者的病死率大幅升高。CDI已成为一个严重的公共卫生问题[3-5].难辨梭状杆菌又称艰难梭菌,是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌,可存活于水、土壤等自然环境、动物体内及医院环境中,其芽孢在医院环境及医务人员手上可存活6个月[3]。1935年,Hall和O'Toole首次从健康的新生儿粪便中分离出该菌,目前发现1%-3%的健康成人、40%-60%的新生儿、1
7、6%-35%的住院患者粪便中携带此菌[6]。C.difficile通常产生两种主要毒素:毒素A是一种肠毒素,对白细胞有趋化作用,主要引起肠道炎症、液体分泌和黏膜损伤,也有一定的细胞毒性作用。毒素B是一种细胞毒素,可刺激单核细胞释放炎性细胞因子,对哺乳动物细胞产生细胞毒性作用。毒素B的毒力较毒素A强10倍[7].C.difficile是一种条件致病菌,在正常人体内的细菌群中所占比例很少,肠道的正常菌群能拮抗和制约C.difficile在肠道定居,故一般不会致病。1978年,Bart
