影响ct的关键因素

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1、实时定量PCR:影响CT的关键因素摘要：实时定量PCR（real-timePCR），通常也称为定量PCR或qPCR，为确定模板中目标序列或目标基因的量提供了一种简单且优雅的方法。它的简单有时也会带来问题，那就是忽视其中起作用的一些关键因素。来自AppliedBiosystems的这篇综述将会强调在建立和评估实时定量PCR反应时必须考虑的这些因素。影响CT值的因素CT（阈值循环，ThresholdCycle）是扩增曲线和阈值线的交叉点（图1B）。它是PCR反应中模板浓度的相对测量。除了模板浓度外，还有许多因素会影响CT的绝对值。我们将要讨论最常见的影响CT值的非模板依赖性因素，并描述如何

2、评估实时定量PCR反应的效果。Figure1.A:Rnisthefluorescenceofthereporterdyedividedbythefluorescenceofapassivereferencedye.Inotherwords,RnisthereportersignalnormalizedtothefluorescencesignalofROX™.Inthisview,Rnisgraphedversuscycle.B:ΔRnisRnminusthebaseline,graphedhereversusthecycleofPCR.C:Amplificationplotshows

3、theLog(ΔRn)graphedversuscycle.图1显示了实时PCR反应扩增图的几个参数。图1B的对数期对应图1C的线性期。在图1C扩增图中，阈值必须设在线性期中。当模板量减少时，CT值随之增加。然而，反应混合物或仪器中的任何改变，只要能影响与CT值计算相关的荧光测定，都会使CT值产生非模板依赖性的变化。因此，在不同条件下或用不同试剂进行的PCR反应产生的CT值不可以直接进行比较。反应液成分的影响  任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。图2显示了某个Taqman探针在两种不同的反应液背景下的原始荧光数据。尽管两组反应的扩增目标、探针和ROX（

4、参比荧光）浓度都相同，反应液A中的荧光信号强度更强。Figure2.RawfluorescencedataobtainedwithoneassayandtwomastermixeswiththesameROX™level.Thedifferenceinsignalisduetothemastermixcomposition.ReactionwasperformedonanAppliedBiosystems7900HTFastReal-TimePCRSystemwithaVIC®MGBprobe.TheXaxisshowstheemissionwavelengthofthefluorop

5、horeandtheYaxisshowstheintensityoftheemission.  因此，如图3所示，产生的△Rn值也不同。注意本底荧光信号基线属于非模板依赖的因素，两种反应液的基线是不同的。CT值的变化并没有反映出反应体系的总体效果（图3B）。灵敏度相当的反应液产生的CT绝对值可能不同。Figure3.MasterMixAandMasterMixBwereusedtoamplifyRNasePinequalamountsofhumangDNAusingtheAppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem.Figure3AshowstheRn

6、versuscyclenumberandthebaselinesforbothreactions.Figure3BshowstheLog(∆ΔRn)versuscyclenumber.Thethreshold(green)issetatthesamelevelforbothmastermixes.TheCTvalueofMasterMixB(CTB)isearlierthanthatofMasterMixA(CTA)foridenticalconcentrationsoftarget,reflectingthelowerbaselineofMasterMixB.ROX参比荧光  Rn值

7、是由FAM荧光除以ROX荧光而得到的比率。因此，假定FAM荧光信号保持不变，ROX量越少，产生的Rn值就越高。这将导致Rn基线的上升，以及随后△Rn的减小和CT值的变化。降低ROX水平而得到的不同CT值，没有对反应的真实灵敏度产生任何影响，却有着意想不到的后果。如图4所示，降低ROX浓度将使CT值的标准偏差增加。标准偏差越大，分辨目标模板浓度间的微小区别的可信度就越低。Figure4.Mastermixescontaining3differen