沉默信息调节因子1（sirt1）基因沉默诱导肝癌细胞老化及机制研究

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1、沉默信息调节因子1（SIRT1）基因沉默诱导肝癌细胞老化及机制研究自然科学基金项目：81171628作者简介：宋春丽，女，28岁，硕士,初级检验师，分子生物学，联系电话：15223340763，Email：498421489@qq.com通讯作者：陈娟，联系电话：13883874026.Email:yixin_xinyuan@163.com宋春丽1，任吉华1，张祯祯2，陶颖1，陈娟11.重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆市4000162.重庆医科大学附属儿童医院感染科重庆市400014[摘

2、要]目的探讨慢病毒介导的沉默信息调节因子1（SIRT1）基因沉默对肝癌细胞老化的影响及机制研究。方法通过慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默SIRT1的表达，并通过Real-timePCR和Westernblot验证SIRT1基因的沉默效果。Brdu标记台盼蓝排斥实验检测细胞增殖生长情况，流式细胞术检测细胞周期变化；β-半乳糖苷酶染色观察肝癌细胞有无老化；Westernblot检测衰老相关基因p53和p21蛋白的变化。结果慢病毒介导的shRNA能显著抑制细胞SIRT1的mRMA及蛋白水平。SIRT1沉默的

3、并且能同时抑制肝癌细胞的增殖，抑制率达70-80%；同时，SIRT1沉默能显著诱导G1期细胞周期阻滞：感染shCont的细胞处于G1期比例约(44.29±0.36)%，而感染shSIRT1-1的细胞处于G1期细胞约（69.20±1.24）%；感染shSIRT1-2的细胞G1期细胞占(65.86±1.75)%。SIRT1沉默后肝癌细胞中衰老相关的β-半乳糖苷酶染色显著增高，阳性细胞约占40-50%显著增加（P<0.05），并伴随衰老相关基因p53和p21蛋白表达增加。结论SIRT1的沉默抑制细胞增殖，并诱导了

4、细胞老化，并同时促进p53和p21蛋白的表达，提示SIRT1基因沉默可能通过p53/p21途径促进细胞衰老。[关键词] SIRT1；肝癌；老化[中图分类号] R344[文献标识码]AGenesilencingofSIRT1inhibitsproliferationandinducesSenescenceinhepatocelluarcarcinomacellsSongChunli1RenJihua1ZhangZhenzhen2TaoYing1ChenJuan11.KeyLaboratoryofMolecul

5、arInfectiousDiseases,MinistryofEducation,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400016,China2.DepartmentofInfectiousDiseases,Children'sHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400014,China【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofSIRT1silencingoncellul

6、arsenescenceinHepatocellularcarcinomacells(HCC)andthemechanism.MethodsSIRT1expressionwasdownregulatedbylentivirusexpressingshRNAtargetingSIRT1andSIRT1proteinlevelwasmeasuredbyreal-timePCRandwesternblot.CellproliferationinresponsetoSIRT1-silencingwasdetermi

7、nedbyBrduincorpationtrypanblueexclusionassayandflowcytometry.ThesenescencewasobservedbySA-β-galstainingandsenescence-associatedproteinsp53andp21werefurtheranalyzedbywesternblot.ResultsLentivirusexpressingshRNAtargetingSIRT1couldsignificantlyknockdownandSIR

8、T1expressionasmeasuredbyreal-timePCRandwesternblot.SIRT1knockdownresultedinadecreaseinproliferationandG1arrest.andIincreasedstainingofsenescence-associatedβ-galactosidasewasalsoobservedinSIRT1-silencingcellsa