醒脑静注射液对大鼠脑损伤后细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

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1、濑她串医学院２００３缓颤＿｝讲究生毕鼗论文材料与方法ｉ，实验材料１．１塞验链物：普遗缓雄性ｗｉｓ话Ｉ大鬣ｉ０８其，侮燕３桶一３５０克，由潮北省实验动物中心赡锝劳盎郧赔医学藏附鼹卡堰审人民医院动物中心代为饲养。ｌ。２主要实验仪器１．２．１构成）１．２．２自制落体颇脑擐傍摸攫（包括：由打击支架、下落击锤、撞击抒三部分ｘＳｚ．４显微手术电钻（上海光电技术有眼公司）１．２．３彩色病理图文分析系统（ｈｉｃａ．Ｑ５００１ｗ型德国产）１．２．４ｉ．２．５Ｌｅｉｃａ切片机（德国产）Ｂｘ一５００ＩＹＭＰｕｓ光学显徽镜１．２．６医蠲芬治尔压力锅１．２．７免疫鳃化湿盒ｌ。

2、２．８微量秽液器１．３生要试剂１．３。ｌ醒脑静注射液，由无锈出拳药业股份鸯隈公霹提供，产品批号０５０６０６。１．３．２ＴＵＮＥＬ染色试剂盒、兔抗鼠Ｂｃｌ一２蚤垂单竞隆捷体、兔抗戴Ｂａｘ蛋白单克隆抗体、兔抗鼠ｃａｓｐａ８ｅ一３单克隆抗体及ｓＰ免疫组化试剂盒均蠹北京中杉金桥生物公司购进。２实验方法２．ｉ损伤模登的建立：参照＆ｅｎｅｙ【３ｌ裔由落体脑损伤装置，由打击支架，下落击锤、撞击秆三部分掩戏，下落击锤重２０９，撞击籽直径‘｜．５ｍｍ。新鲜配藏３％戊巴眈妥钠溶液，按４５糯酚ｇ雩亍裴腔癣辞，将损伤缀大鬣置予平台上，俯辞位雷定头部，消毒后矢袄切开头皮，暴露右

3、联鹭，趣磨钻在矢状缝謦ｌ。５ｍｍ，孛线旁２．５ｍｍ处瘩一直径约５ｍｍ的骨蜜，避免擐馈硬脑膜，姆撞抒头端置于努蜜硬膜外。月２蚀夔黪击锤扶３０ｃｍ商处自由坠落冲击撞姆，冲击力为Ｏ．０４８牛顿ｔ秒（Ｎ・ｓ），造成严整的齄挫裂伤，硬膜保持完整，骨窗用骨蜡封闭詹缝合头皮。２．２动物分鳃：普通毅ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠１０８只，体燕３００一３５０９，随机搬动物分为假手术组、损伤对照组和醒脑静注射液治疗组。每组３６只。然后每组再分为伤后６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ和１６８ｈ６个皿组，每亚组６只。醒脑静治疗组在致伤后ｌＯｍｉｎ肉黢澄肉注射醒脑静注射液２０ｍ１，ｋｇ，

4、每日一次至遣模结束。损伤对照组溅腹腔海给予等量０．９％蕺亿销溶液。２．３处廷及取毒｝分别按备时阈点掩动掺断关处琵，立帮取出全黪组织，置子４％翡中性帮醛溶渡中国定，取创傍周围黪组织镘成蟮块备用。备用。３．指标检测：３．１ＴＵＮＥＬ检羽４３．１．ｉ切５“ｍ厚的石蝤切片，并裱予多聚赖氨酸玻片上，６０℃恒温箱ｌ小时固定；３．ｔ．２切片在二甲苯Ｉ和ＩＩ串分澍脱蜡ｌＯ分钟，然后经ｉ００％、９５％、８０％梯度潘糖脱水备１分钟詹，宠分东洗；湖北中医学院２００３级硕士研究生毕业论文３．１．３用２％蛋白酶Ｋ将组织切片于３７℃下孵育３０分钟，以消除遮盖ＤＮＡ片段的璐白质，Ｏ

5、．０１ｍｏｌ屈ＰＢｓ冲洗３分钟，反复３次；３．１．４擦干样品阖掰酶隶份，将刊ＮＥＬＩ液（末端脱氧核替酸转移酶）和删ＮＥＬⅡ（带荧光索的ｘ—ｄｕ口）按１：９充分溅匀后，每玻片滴５０ｕｌ，在免疫组化遵鑫申３７℃下孵弯３０分镑，ＰＢｓｊ唾Ｉ洗３分键，反爱３次；３．１．５样品加适量ＤＡＢ显包液约１０分钟，自来水充分水洗终止：３．１．６苏木索复染２分钟，２％盐酸酒精分化１０秒钟，迅速用流水冲洗２分钟：３。ｌ。７常蕊绨度溪穗魏承、二等苯透瞬、串注橱藏辩片。结果判定：细胞核染色燕棕黄龟或棕红色定义为ＴＵＮＥＬ阳性，４００高倍光学显徽镜下，每张切片任选ｓ个视野，计算平均

6、阳性细胞数。３。２免疫鳃亿ｓＰ法实验步骤３．２．１切５¨ｍ厚的石蜡切片，并裱于多聚赖氨酸玻片上，６０℃恒温箱１小时固定；３．２．２３％Ｈ２０２室滠孵育３０分钟，以灭活内源性过氨亿物酶的活性；３．２－３蒸馏水冲洗，ＰＢＳ浸泡５分钟；３。２．莓蕊深燕移菱将勰∞趣羚。ＯｌＭ羲捣撩酸釜缓冲渡注入不锈锅压力镯中舞热至沸腾。然后将切片置于特制塑料架上，敞入锅内，使切片位于液面下，旋锅压阀。当压力锅舞始慢慢喷气时计鲢，２分铮后将压力锅脱舞热源，冷隶冲藿室湿君，取下气闯，打开锅盖，取毒仞芹，蒸馏枣冲洗２分锌×３次；３．２．５不浚；３．２。６滴加５％正常山羊血清（

7、ＰＢｓ稀释）封闭，室温孵宵１０分钟，倾去血清，滴力口一抗（Ｂａｘ—Ａ－ｂ：１：１５０；Ｂｄ一２一ＡＬｂ：１：１５０；Ｃｈｓｐａｓｅ一３一ＡＬｂ：ｌ：１００）于缎织上，３７℃孵商半小时，４℃冰箱过夜，ＰＢｓ冲洗，５分钟ｘ３次：３．２．７漓拳垒赣素纯羊抗甄二撬，３７凌孵密３融矗ｎ，ＰＢｓ洗５分锌ｘ３次；３．２．８滴加辣根过飘化物酶标记的链霉卵由索（即用型），３７℃孵育３０分钟，ＰＢｓ浇５分钟ｘ３次；３．２＋９样品加适量ＤＡＢ显色液。塞温镜下控制反成时间，ｉ；乏片子出现较强的棕黄色詹终止染色，水洗５分钟；３。２。１０荔本素复象２分镑，２％盐酸灌壤分亿５秒锌居，

8、遗速翔滚拳冲洗２分锌；３．２．１１常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。结