习惯性流产胎盘滋养细胞凋亡及fas、fasl的表达

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1、习惯性流产胎盘滋养细胞凋亡及Fas、FasL的表达作者：王淑梅杨宝朋曹永【关键词】习惯性流产胎盘滋养细胞凋亡Fas、FasL习惯性流产是指连续发生2次或2次以上的自然流产，发生率约1%[1]。近代生殖免疫研究表明，习惯性流产的病因除染色体、解剖和内分泌异常外，约50%～60%与免疫有关。现已证实，细胞凋亡(apoptosis)是一种生理现象，但细胞凋亡停滞或过速均会导致疾病的发生。由Fas/FasL介导的特异性活化T淋巴细胞的凋亡，在外周T淋巴细胞的免疫耐受中起重要作用[2]。研究胎盘绒毛滋养细胞凋亡及Fas、FasL基因蛋白的表达，旨在从细胞

2、与分子水平，阐明习惯性流产的病理变化及免疫发病机制，为临床治疗提供理论依据。对象与方法1.对象：2004～2007年在本院治疗的习惯性流产患者28例，其中稽留流产18例，难免流产6例，不全流产4例。患者均为早期流产(孕周≤12周)，年龄23～38岁。流产的诊断标准依据参考文献[3]。选择同期在本院计划生育门诊接受早孕人工流产的健康妇女25例，既往无不良孕产史，均有1胎以上正常分娩史，年龄24～35岁者为正常对照组。2.标本处理：妊娠产物自宫腔刮出后，将绒毛或部分胎盘组织用生理盐水漂洗去掉血液后，立即用10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋，连续切片

3、。每张组织切片厚约5μm，至60℃烤箱72h，使切片紧密粘附。3.免疫组化染色:Fas和FasL蛋白测定采用免疫组化链雷菌抗生物素蛋白过氧化酶(streptavidinperoxidaseconjugatemethod,SP)方法。Fas和FasL免抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒及SP试剂盒购自福建迈新公司，操作方法参照说明书进行。用已知的FasL阳性乳腺癌切片(由博士德公司提供)作阳性对照，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)代一抗作为阴性对照。4.末端脱氧核苷核转移酶介导的生物毒酰化脱氧尿苷三磷酸生物系原

4、位缺口末端标记法(TUNEL)染色：原位细胞凋亡检测试剂盒(insitucelldeathdetectionkitII,Ap)购自武汉博士德生物工程有限公司，其中末端脱氧模苷酸转移酶(TdT)由美国Promega公司提供，操作按照产品说明书进行，5溴4氯3吲哚磷酸/四氮唑蓝(BCIP/NBT)显色。用已知凋亡细胞阳性的大鼠大肠标本(由武汉博士德公司提供)做阳性对照，反应中省略TdT作为阴性对照。5.结果判定：Fas和FasL定位于胞膜和胞浆内，棕黄色为阳性细胞，采用MIAL2000医用彩色病理图像免疫组化测量系统对2组切片进行半定量

5、分析，每组随机选取10×40高倍视野10个，进行免疫组化半定量测定。TUNEL以细胞核内出现紫蓝色颗粒为阳性细胞，每例随机选取10×40高倍视野10个，计算凋亡指数(apoptoticindex,AI)。6.统计学处理：计量资料采用±s表示，组间比较采用独立样本t检验。结果1.基因蛋白表达：2组胎盘绒毛的细胞滋养细胞、合体滋养细胞均有Fas、FasL的表达，在绒毛间质中Fas、FasL也呈阳性表达。2组间Fas、FasL蛋白的表达，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。表12组Fas、FasL平均灰度的比较2.细胞凋亡的检测：在正常

6、组及习惯性流产组的胎盘绒毛中均可见到细胞核染成紫蓝色的凋亡细胞及凋亡小体，在绒毛间质中亦可看到调亡细胞，但正常组的凋亡细胞着色较淡，2组的凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。表22组胎盘绒毛细胞凋亡情况比较讨论1.胎盘绒毛细胞凋亡增多与习惯性流产的关系：细胞凋亡是细胞的主动死亡过程，在维持机体形态及功能方面起重要作用。正常情况下，细胞凋亡与胎盘的生长发育及老化密切相关，而在病理状态下，细胞凋亡明显增多则是病理性现象发生、发展的重要标志[4，5]。本研究发现，正常早孕及习惯性流产胎盘绒毛的滋养细胞和合体滋养细胞均有细胞

7、凋亡的发生，且习惯性流产患者比正常早孕妇女的凋亡指数明显增加，此结果与Vadillo等[5]的研究结果一致，说明细胞凋亡参与了正常妊娠胎盘绒毛的生长发育，而习惯性流产患者胎盘绒毛细胞凋亡增加则属于一种病理现象，因为非生理性细胞凋亡增多，必然引起胎盘发育和循环功能障碍，导致流产发生。2.Fas、FasL基因蛋白表达与习惯性流产的关系：Fas又称APO1或CD95，属于TNF或NGF受体家族中的一员，FasL属于TNF家族，二者均为细胞凋亡的调控因子。FasL与其受体Fas结合可导致携带Fas的细胞凋亡[6]。由于习惯性流产的发生主要与免疫有关，

8、因此，不少学者认为，习惯性流产是免疫排斥的结果。现已证实，由Fas/FasL介导的针对特定抗原的活化T细胞的凋亡在妊娠免疫耐受中起着十分重要的作用，且