ief使用过程中常见问题及解决方法

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1、IEF使用过程中常见问题及解决方法以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。问题可能原因解决方法初始电流低或为零•IPG胶条与电极接触不好.•检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上.•PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全.•检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触.•IPG胶条水化不完全•确保IPG胶条完全并平均地进行水化。检查水化液体积及水化时间.在升压过程中电压

2、不上升.•盐浓度过高•检查盐浓度并对样品进行除盐处理.电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢•Bio-Lyte浓度过高•将Bio-Lyte浓度降至0.2%(v/v).•对不同尺寸的IPG胶条和pH梯度电压设置过高.•在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦.•过多的样品在水化过程中未能进入胶条,或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨•如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条,或在聚焦前除去多余的样品液.电压及电流波动很大.(同时电阻错误信息会显示)•IPG胶条中有水化较差的区域,或IPG胶条在运行过程中已经烧干.•检查水化缓冲液体

3、积及时间.确保在水化期间水化缓冲液平均地分配.•限流过高.•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.问题可能原因解决方法烧胶条(这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示.)•限流过高.•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.•IPG胶条已经烧干.•确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干•电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.•确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态.•水化缓冲液成份不合适,盐浓度过高.•检查水化缓冲液浓度。必要时重新配制缓冲液.双向电泳实验中常见问题一、水平条纹出现的问题:胶上

4、出现连续性横纹。可能的原因:蛋白质没有完全和稳定溶解。推荐解决的方法:·用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS,ASB-14），两性电解质和还原剂（DTTorTBP）非常重要。每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：o8–9Murea,4%(w/v)CHAPS,2mMTBPor50mMDTT,40mMTris,0.2%(w/v)Bio-Lyte3/10Ampholyteo7Murea,2Mthiourea,4%(w/v)CHAPS,2mMT

5、BPor50mMDTT,40mMTris,0.2%(w/v)Bio-Lyte3/10Ampholyte·样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。·进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（>10,000rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。推荐产品:ReadyPrepproteinextractionkit(totalprotein/全蛋白)出现的问题:出现不连续的横纹。可能的原因:样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA,RNA),脂类,多糖和酚类化合物。

6、推荐解决的方法:以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2-Dcleanupkit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中

7、的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。最终，样品中SDS的含量须低于0.25%(w/v)，样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：1。如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物质会增加样品

8、的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从