分光光度法测定胆固醇含量_化学_自然科学_专业资料

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1、实验八、分光光度法测定胆固醇含量一、实验目的1、学习721分光光度计的使用2、掌握分光光度法测定胆固醇含量的原理3、学习并掌握利用分光光度法制作胆固醇含量标准曲线的方法二、实验原理当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液。假设入射光强度为I0，透过光强度为It，溶液的浓度为C，液层宽度为b，则T＝－I0It（透光度或透光率）（朗伯－比尔定律的数学表达式）式中：A为吸光度，没有单位K随C、b的单位而不同C：g/L,b:cm,k:L/g·cm,为吸光系数；C：mol/L,b:cm,k:L/mol·cm,为摩尔吸光

2、系数以上式子表明：当一束单色光通过有色溶液时，其吸光度与溶液浓度及宽度成正比。当k、b都一定时，A与C成正比，因此若已知浓度溶液（即试样溶液）的吸光值As，在相同条件下测出未知浓度溶液的吸光值Ax，则试样溶液的浓度Cx可通过下式求出：（标准对照法，适用于非经常性的分析工作）若是经常性的批量测定，则应用标准曲线法，即配制一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处，用同样的比色皿分别测其吸光值。作出“吸光值/含量”的标准曲线，在相同条件下测定未知浓度试样的吸光值，直接可从标准曲线上查出相应的浓度。三、实验药品及仪器药品:FeCl3·6H2O，磷酸(

3、A.R.即“分析醇”)，浓硫酸（A.R.），胆固醇（C.P.），无水乙醇。试剂：10％三氯化铁溶液：10gFeCl3·6H2O溶于磷酸，定容至100ml，存棕色瓶中，冷藏磷硫铁试剂（P-S-Fe试剂）：取1.5ml10％三氯化铁溶液于100ml棕色容量瓶加浓硫酸至刻度。胆固醇标准溶液（0.08mg/ml）：称取80mg胆固醇溶于无水乙醇定容至100ml，配制成10×的标准贮存液。10×贮存液用无水乙醇稀释10倍，即为胆固醇标准溶液。仪器：721分光光度计，比色皿，试管，移液管四、仪器使用（721分光光度计）1.接通仪器电源开关，打开比色皿暗

4、箱盖，选择所需的单色光波长,预热20分钟；2.将盛溶液的比色皿装入暗盒中（一般装空白溶液的比色皿放在第一格，装待测溶液的比色皿放在后面）3.打开比色皿暗箱盖（光门自动关闭），调节“0”电位器，使电表指针指“0”（透光率为0），然后将盖子盖上（光电管受光），这时空白溶液的比色皿须正对于光路上，调节“100％”电位器，使电表指针指在“100”（透光率100%），若调不到100，可提高灵敏度。4.连续几次调“0”和“100”后，就可以进行测定。测定时，将比色皿拉杆轻轻拉出一格，使第二个比色皿内的待测溶液进入光路，此时指针所指的读数就是该溶液的吸光

5、度。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。5．实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净。注意事项：1.读数时，视线要正对着指针，表上两排数据不要读错，小数点也不要读错！2.放大器灵敏度有五档，“1”最低。其选择原则是保证能使空白档良好调到“100”情况下，尽可能采用低灵敏度，这样仪器将有更高的稳定性。所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须重新调“0”和“100”。3.拿比色皿时用手捏住毛玻璃两面，切不可触摸光面。每次使用完毕，应洗净，滤纸吸干，不可用碱液和强氧化剂洗比色皿，避免腐蚀玻璃或使皿粘结处脱胶

6、。4.比色皿放入比色皿架前，须用擦镜纸吸干外壁的水珠。五、实验内容1、配制10％三氯化铁溶液、磷硫铁试剂、胆固醇标准溶液2、打开721分光光度计预热20分钟3、取6根试管，编号1-6，各管分别加入0.08mg/ml胆固醇标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，以无水乙醇补足至2.0ml，然后1-6管均各加入2.0ml磷硫铁试剂，摇匀。10分钟后分别转移到0.5cm光径的比色皿内，用721分光光度计在560nm波长的单色光下，先用1号管的空白对照调“0”和“100”，然后同等条件下分别测定2-6管的吸光值A，记录数值。4、算出各

7、管胆固醇的实际浓度（单位：mg/ml）,然后以胆固醇浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，作标准曲线。备注:各管胆固醇实际浓度C的计算公式C实际=胆固醇标准液原浓度×移取的胆固醇标液体积V÷各管总体积=0.08×V（胆固醇体积）÷4(单位为:mg/ml)六、实验数据记录管号0.08mg/ml胆固醇标准液体积V（ml）无水乙醇体积（ml）磷硫铁试剂体积（ml）各管总体积(ml)各管胆固醇实际浓度C实际(mg/ml)各管吸光值A102.02.04.020.41.62.030.81.22.041.20.82.051.60.42.062.002.0用

8、坐标纸画出标准曲线（1）胆固醇的生理功能：参与血浆蛋白的组成；细胞膜的结构成分；胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。（2）临床意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂类代谢的指