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1、血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化论文杨军,伍卫梁蔚文,王景峰,潘秋辉,方昶黄至斌【摘要】【目的】研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43(Cx43)表达的变化及与细胞周期分布的关系。【方法】分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达,用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43表达量的关系。【结果】血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强，S期、G2-M期细胞百分比增加,细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低，Cx4
2、3蛋白表达低于对照组，Cx43mRNA表达水平也较对照组明显下调，Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。【结论】血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调，导致Cx43蛋白表达亦出现下调，这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关,提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程，而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。【关键词】血管紧张素Ⅱ；心肌细胞肥大；连接蛋白43；缝隙连接；细胞周期JSUNYat-senUniv(MedSci),2007,28(3):292-296心肌肥大是多种心血管疾病过程中
3、的一个共同的病理过程.freelyocardialhypertrophy)是心血管疾病中的一种独立危险因素，心肌肥大本身即明显增加心血管病死亡率，而其内在机制认为与心肌肥大所致的电生理重构有关。目前发现细胞间缝隙连接的改变在心肌电生理重构起着重要作用。缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是心肌细胞间隙连接的主要蛋白成分,.freela)；5-溴脱氧嘧啶核苷(Sigma)；胰蛋白酶(Difco)；兔抗大鼠Cx43多抗(博士德公司)；FITC－羊抗兔IgG(博士德公司);缬沙坦原药(北京诺华制药有限公司)；RNA逆转录试剂盒(TOYOBO公
4、司)；TrizolRNA提取液(MRC公司)；PCR引物(北京赛百特公司合成)；PCR主要试剂购自TAKARA公司；其它常用生化试剂均为国产分析纯。流式细胞检测仪(EpicsAltra型,美国BeckmanCounter公司)。1.2心肌细胞培养及分组每次取1～3d龄的EM-F12培养液重新悬浮细胞。将细胞悬液转移至75cm2培养瓶中,置于5%CO2培养箱内37℃差速贴壁90min，再取未贴壁细胞均匀地接种96孔及6孔培养板上继续培养。仅在培养第一天中加0.1mmol/L的5-溴脱氧嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长，24h后换无5-溴脱氧嘧啶核苷的培养基8
5、。约3d后,心肌细胞成簇生长并出现搏动。1周左右,细胞密集紧密接触，达到同步收缩，此时培养心肌细胞可用于实验。实验分为两组：血管紧张素Ⅱ组：每天所换培养液中加血管紧张素Ⅱ（以无血清培养液溶解）使终浓度为1.0×10-6mol/L，正常对照组(control)：培养液中加等量无血清培养液。处理72h后在显微镜下观察细胞形态，细胞计数，同时分别取两组细胞作MTT、细胞周期检测、免疫荧光和RT-PCR检测。1.3四氮甲唑蓝(MTT)法测定对心肌细胞增殖的影响采用MTT法检测细胞的增殖活性。取原代培养心肌细胞接种于96孔平底细胞培养板上，每组10个孔，培养2
6、4h，然后换含10mL/L血清的培养液，24h后,实验组换用添加含浓度为1.0×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ的无血清的培养液200μL，对照组换含相同浓度DMSO的无血清的培养液200μL，72h后,加入MTT(5μg/L)20μL/孔继续培养4h。加入二甲基亚砜原液200μL/孔，酶联免疫检测仪下选择波长490nm测定酶联免疫吸附A值。1.4流式细胞仪测定细胞周期取血管紧张素Ⅱ（终浓度1.0×10-6mol/L）处理72h后的细胞及对照细胞制成单细胞悬液，以750mL/L酒精固定细胞后，加入200μLPI(0.1×10-3mg/L),4℃染色1h
7、后上机检测。流式细胞检测仪检测。经数据获取软件分析，重复4次。1.5免疫荧光检测Cx43表达细胞以1.0×105/mL的密度接种于置小盖玻片的24孔培养板,取血管紧张素Ⅱ处理72h后，取出盖玻片，PBS冲洗，950mL/L乙醇固定，1％TritonX-100室温孵育20min。滴加一抗Cx43,4℃过夜后滴加Cy3-羊抗兔IgG(1∶100)，荧光显微镜下观察并进行照相分析。1.6逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)参照Genebank资料设计并合成引物6。引物序列为:Cx43,F:5′-TTGTTTCTGTCACCAGTAAC-3′,R:5′-GAT
8、GAGGAAGGAAGAGA-AGC-3′,扩增序列长度为588bp;β-actin，F:5′-CACGGC
