黄连提取物对角质形成细胞增殖活性的影响论文

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1、黄连提取物对角质形成细胞增殖活性的影响论文.freelRNA表达水平变化。结果不同浓度(10.46～167.3?g/mL)黄连提取物处理HaCaT细胞24～72h后,细胞增殖受到明显抑制,抑制率最高达75.5%,且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。黄连提取物可以下调HaCaT细胞内的角蛋白K6和Bcl-2mRNA转录水平,随着浓度的增高,诱导其表达水平降低的趋势越明显,呈现一定的浓度依赖性。结论黄连提取物可以明显抑制HaCaT细胞的增殖,其机制可能与下调角蛋白K6和原癌基因Bcl-2的表达有关。【关键词】黄连;HaCaT细胞;角蛋白K6;Bcl-2Abstr

2、act：ObjectiveTostudytheeffectsofCoptisChinensisextractontheproliferationofHaCaTcellsandrelatedmechanisms.MethodsCulturedHaCaTcellsorphologychangesicroscopy.HaCaTcellspoliferationRNAexpressionchangesofkeratin6andBcl-2i-quantitativereversetranscriptionPCR.ResultsAfterincubationL)ofCo

3、ptisChinensisextractfor24to72h,HaCaTcellsaticallyandthehighestinhibitionrateRNAexpessionofkeratin6andBcl-2anner.ConclusionsExtractofCoptisChinensiscaninhibittheproliferationofHaCaTcell.ItmightberelatedtothedopPCR仪(美国PE公司),Tannon3500R凝胶成像系统(天能公司),CO2培养箱(SANYAO),倒置显微镜(上海光学六厂37XB),RNA

4、/DNA检测仪(PharmaciaBiotech),BIO-RAD550型酶标仪。2实验方法2.1受试药物制备精密称取黄连粉末30g(过20目),加8倍量80%乙醇加热回流提取3次,每次2h,3次滤液合并,滤液减压浓缩为干浸膏。取0.1g干浸膏溶于0.6mLDMSO中(相当于原药材浓度为669.3mg/mL)。临用前用DMEM培养基将药液稀释为669.3、502.0、334.7、167.3、83.66、41.83、20.92、10.46?g/mL(DMSO0.1%)。2.2HaCaT细胞的培养HaCaT细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液(含100万U/L

5、青、链霉素)于37℃、5%CO2饱和湿度下贴壁培养,2d换液1次,待细胞长成致密单层后,以0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养。2.3台盼蓝染色法检测HaCaT细胞活力HaCaT细胞以1×104个/mL的细胞悬液,接种于25mL培养瓶中,阴性对照、各浓度组分别设3个重复,每瓶4mL,置37℃、5%CO2孵箱培养。培养24h后,吸弃各瓶培养液,加入不含药物及含有相应浓度药物的新鲜培养液。培养48h后,消化细胞,进行台盼蓝染色,倒置显微镜下观察,血球计数板计数。细胞活力=(总细胞数-不排斥染料的蓝色细胞个数)/总细胞数×100%。连续计数3次,取其平均值,实验重复

6、3次。2.4倒置显微镜观察HaCaT细胞形态HaCaT细胞以1×104个/mL,2mL接种于6孔培养板上,培养24h后,吸弃各孔培养液,加入不含药物及含有相应浓度药物的新鲜培养液。培养48h后,镜下观察细胞的形态并拍照。2.5MTT法检测HaCaT细胞增殖HaCaT细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中,培养24h后,吸弃各孔培养液,加入新配制的不同浓度的药液,不加药液的细胞培养液作为阴性对照组,并以不含细胞的培养基作为空白对照用于仪器调零。分别在加药培养24、48、72h后,每孔加入20?LMTT(5g/L),继续孵育4h,吸弃上清液,加入150?L

7、DMSO,振荡10min后,于酶标仪上测定490nm波长处的吸光度值,计算生长抑制率及半数抑制浓度(IC50)值,每组重复5孔,进行3批实验。2.6RT-PCR法检测角蛋白K6、Bcl-2基因表达水平2.6.1细胞总RNA的提取HaCaT细胞以2mL(1×104个/mL)接种于6孔培养板上,细胞长至60%～70%融合时,吸弃旧的培养液,加入不同浓度的药液(10.46、20.92、41.83?g/mL)以及不含药液的细胞培养液。培养24h后,严格按照TRIpureLSReagent说明书进行细胞总RNA的提取,-20℃保存备用。每组重复3孔,实验重复3次。测定

8、260nm和280nm的吸光度值,计算RNA浓度并评