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《云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第23卷第4期2001年12月湖北大学学报(自然科学版)Vol.23No.4JournalofHubeiUniversity(NaturalScienceEdition)Dec.,2001文章编号:1000-2375(2001)04-0366-04云南红豆杉细胞培养和紫杉醇生产陈永勤1,朱蔚华2,吴蕴祺2,胡秋2(1.湖北大学生命科学学院,湖北武汉430062;中国医学科学院,中国协和医科大学药物研究所,北京100050)摘要:研究了在固体和液体培养条件下云南红豆杉(Taxusyunnanensis)细胞系TY6生长和紫杉醇积累的动态及培养基中无
2、机氮源形式对其生长的紫杉醇形成的影响.结果表明,在固体和液体培养条件下,云南红豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态相似,但液体培养时细胞生长周期缩短了7d,紫杉醇含量降低了1倍;新形成的细胞需要经过一段时间生长后才有较高的紫杉醇合成能力;培养基中硝态氮浓度高有利于细胞生长,铵态氮浓度高有利于紫杉醇形成;在培养第12d时用铵态氮培养基更换硝态氮培养基可使悬浮细胞的紫杉醇产量达到8.5mg·L-1,比对照高1.6倍.关键词:云南红豆杉;细胞培养;紫杉醇;无机氮中图分类号:Q813.1文献标识码:A从红豆杉属植物中分离出来的紫杉醇(Taxol)已成为临床上治
3、疗乳腺癌和卵巢癌的重要药物1.由于受红豆杉属植物资源的限制,人们一直试图利用化学合成方法和植物细胞工程技术来解决紫杉醇药源短缺的问题,但均未达到商业应用水平.在红豆杉属植物细胞工程研究方面,人们已对多种红豆杉进行了细胞培养,并在细胞培养技术和提高紫杉醇含量等方面取得了一些进展1.Fett-Neto等2和Srini2vasan等3还分别研究了培养周期中东北红豆杉细胞和欧洲红豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态.罗建平等4曾报道了云南红豆杉愈伤组织的生长动态,但没有报道紫杉醇含量的变化.我们在进行云南红豆杉组织培养时,选到了一个紫杉醇含量较高的细胞系(TY
4、6),并研究了它在固体培养和液体培养时的生长和紫杉醇积累动态及培养基中无机氮源形式对其生长和紫杉醇生产的影响.1材料与方法1.1细胞系的建立云南红豆杉(TaxusyunnanensisChengetL.K.Fu)愈伤组织的诱导和继代培养方法同前5.悬浮细胞培养是通过将愈伤组织接种在液体增殖培养基中、在摇床上震荡培养建立起来的,第一代为7d,第二代和第三代为10d,以后每15d继代1次.培养基和培养条件同前6.1.2愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇积累动态将继代20d的愈伤组织接种在增殖培养基上,每隔5d随机取6瓶,记录鲜重;烘干后再称其干重,并分析
5、紫杉醇含量.悬浮细胞培养时,为了使各瓶的细胞均匀一致,先让各瓶细胞培养物静置片刻,倒出上层培养液,再将剩下的细胞培养物倒入装有新鲜增殖培养基的2000mL三角瓶中.摇匀后,分装到250mL三角瓶中,每瓶80mL,接种量为7.09±0.15g·L-1干细胞.接种后每3d取样一次,每次随机取3瓶.细胞离心收集,烘干后用于细胞干重和紫杉醇含量的测定.无细胞的培养液用于紫杉醇和糖浓度测定.1.3NO-和NH+对愈伤组织和悬浮细胞生长和紫杉醇含量的影响在愈伤组织试验中,设4种NO-343和NH+浓度不同的处理组合(表2).用KNO和HNCl调节各处理的NO
6、-和NH+浓度,用KCl平衡其43434收稿日期:2000-11-24基金项目:湖北省教育厅科研基金(98B004)作者简介:陈永勤(1961-),男,博士,副教授K+浓度.NHCl为过滤灭菌,其它成分为高温灭菌.培养30d.4悬浮细胞培养方法同1.2,但培养容器为500mL三角瓶,每瓶130mL.培养至第12d时,将3瓶的培养基倒尽,倒入无机氮全为NH+的新鲜增殖培养基,每瓶培养物最终体积与对照大致相同.试验至第419d结束.细胞离心收集,烘干后用于测定干重和紫杉醇含量.1.4生长分析、糖浓度和紫杉醇含量测定固体培养时,难以使各瓶的接种量一致,
7、所以采用增长指数作为考察愈伤组织的生长指标.增长指数=(收获鲜重或干重-接种鲜重或干重)Π接种鲜重或干重.培养基中糖的浓度用硫酸—苯酚法测定7.细胞中紫杉醇含量的测定按Wu等8建立的高效液相色谱法进行.无细胞培养液用等量的二氯甲烷萃取2次,二氯甲烷部分减压蒸干后用甲醇定容,其后处理同细胞样品.高效液相色谱条件为:Shi2madzuLC-6A高效液相色谱仪,ShimadzuSPD-6A紫外检测器,Rheodyne7125进样阀和ShimadzuC-R3A积分仪.色谱柱为PlantinumC18柱(250mm×4.6mm,5μm,Alltech,US
8、A),流动相为甲醇—乙腈—水(25:35:45),流速为1.0mL·min-1,检测波长为227nm.样品中紫杉醇含量通过外标法计算得出
