超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮含量

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1、超高效液相色谱法测定大豆异黄酮胶囊中异黄酮含量【摘要】目的建立同时测定大豆异黄酮胶囊中6种异黄酮含量的超高效液相色谱法（HPLC）。方法采用AcquityUPLCTMBEHC18柱（1．7μm，2．1mm×50mm），流动相为甲醇-0．05mol/L乙酸胺（pH4．6），梯度洗脱，检测波长为260nm，流速为0．4ml/min，柱温为40℃，外标法测定。结果大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在0．02600～0．2600mg/ml、0．02625～0．2625mg/ml、0．02675～0．2675mg/ml、0．012650～0．12650mg/ml、0．

2、012525～0．12525mg/ml、0．012750～0．12750mg/ml范围内线性关系良好（r≥0．9930），加样回收率（6例）分别为：98．5%、98．8%、98．2%、97．7%、98．0%、97．3%。结论本法快速、简便、准确、灵敏度高、成本低，适用于大豆异黄酮胶囊中异黄酮的含量测定及质量控制。【关键词】大豆异黄酮胶囊;异黄酮;超高效液相色谱法;含量测定6大豆异黄酮是大豆生长中形成的一种次生代谢产物，是生物黄酮的一种，也是天然的植物雌激素，具有抗衰老、抗肿瘤、防治骨质疏松、预防心脑血管疾病，以及抗高血压、降血脂等功效。大豆异黄酮胶囊性质稳定，安全有效，在临床上和保健

3、品领域上得到广泛应用[1-2]。大豆异黄酮又名类黄酮，目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种，其主要成分有大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素。采用传统HPLC法测定时，检验周期长，低含量组分的检出效果不理想[3]。UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9、3及1．7倍[4]，本文采用超高效液相色谱法同时测定大豆异黄酮中6种有效成分的含量，快速、准确且成本低廉。1仪器与试药WatersAcquityUPLC超高效液相色谱仪，紫外检测器，Empower2色谱工作站。大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素对照品由中国药

4、品生物制品检定所提供，含量测定用大豆异黄酮胶囊（20060501、20060502、20060503）由广东康雅生物制药公司提供。甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水。2实验方法2．1色谱条件AcquityUPLC�TMBEHC-18柱，1．7μm，2．1mm×50mm，甲醇-0．05mol/L乙酸胺（pH4．6）为流动相，梯度洗脱，洗脱条件见表1；检测波长为260nm；流速为1．0ml/min；柱温为40℃；进样量为26μl。对照品液、样品液及阴性对照液的色谱图如图1所示。0．05mol/L乙酸胺溶液（pH=4．6）∶准确称取3．85g乙酸铵于烧杯中，用适量水溶解转移至1000ml容量瓶

5、中，加水500ml，加入3．00ml冰醋酸，摇匀，加水至刻度，摇匀。2．2溶液制备2．2．1对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷干燥至恒重的大豆苷（Daidzin）、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)和染料木素(Genistein)对照品，加甲醇制成每1ml分别含0．10、0．10、0．10、0．05、0．05、0．05mg的溶液，作为对照品溶液，用0．22μm的微孔滤膜过滤，即得。3实验结果3．1线性关系分别称取对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml中含大豆苷1mg、黄豆黄苷1mg、染料木苷1mg

6、、大豆苷元0．5mg、黄豆黄素0．5mg、染料木素0．5mg的混合溶液，摇匀，作为储备液。分别精密量取储备液0．25、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5ml置于10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度。按上述色谱条件下平行测定36次，以峰面积的平均值Y对浓度X（mg/ml）进行线性回归。计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的回归方程3．2重复性试验取大豆异黄酮胶囊（20060501），按“2．2．2”项下方法平行制备5份样品溶液，分别测定其含量，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量测定结果的RSD分别为0．8%、0．9%、0．5%、1．0

7、%、1．3%、1．6%。3．4检测限和定量限将对照品溶液逐步稀释后进样，以信噪比为3计，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的最低检测限浓度分别为5．2、4．8、6．5、3．8、4．2、4．6ng，以信噪比为10计，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的定量限浓度分别为38．5、32．3、40．8、28．4、34．0、38．8ng。3．5加样回收率取己知含量的大豆异黄酮胶囊内容物9份各125mg，精密称定，分别精密加