青蒿琥酯对膀胱癌t―24细胞生长的影响

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1、青蒿琥酯对膀胱癌T―24细胞生长的影响　　摘要：目的探讨青蒿琥酯（artesunate，Art）对人膀胱癌T-24细胞的抑制作用及机制。方法用不同浓度的Art干预人膀胱癌T-24细胞，采用MTT法检测用药后细胞增殖的改变；划痕实验检测鱼藤素对细胞迁移能力的影响；流式细胞术（FCM）检测细胞周期的改变和凋亡率。结果与对照组比较，Art可显著抑制人膀胱癌T-24细胞株增殖（P<0.01）；划痕实验结果显示，鱼藤素可降低T-24细胞的迁移能力；FCM结果显示Art可使人膀胱癌T-24细胞周期阻滞在G0/G1期，并

2、可诱导T-24细胞的凋亡（P<0.01）。结论Art可显著抑制T-24细胞的增殖以及降低其迁移能力，其机制可能与Art使T-24细胞生长周期阻滞在G0/G1期并诱导其凋亡相关。　　关键词：膀胱癌；T-24细胞；青蒿琥酯；凋亡；细胞周期　　膀胱癌是泌尿外科最常见的肿瘤，现仍以手术治疗为主，辅以化疗以及免疫治疗等其他治疗方法，其中化疗在其中起着关键的作用，但疗效不是很显著，治疗指数低，且副反应较大[1]，因此寻找新的、疗效显著的药物迫在眉睫。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我国传统中药自主知识产权药品

3、，但近期研究发现青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞均有一定的抑制效应，显示出非常好的疗效[2-6]。但其对膀胱癌的抑制作用尚未见相关报道。因此，本实验通过观察Art对人膀胱癌T-24细胞的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机制，为Art下一步临床应用提供相应的临床理论依据。　　1资料与方法　　1.1一般资料人膀胱癌T-24细胞由华中科技大学同济医学院惠赠；DMEM培养基为美国Gibco公司产品；优级胎牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品；MTT为美国Sigma公司产品；Art注射液为桂林南药股份有限公司（批号0

4、30801）产品；磷脂结合蛋白（AnnexinV，LBMs306BB）以及碘化丙啶（PI）为美国Caltag公司产品。流式细胞仪为美国Beckmancoulter公司产品；酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养人膀胱癌T-24细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基（含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素）中，于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，用0.25%的胰酶进行消化传代，取对数生长期的细胞进行相关实验。　　1.2.2细胞增殖抑制试验（MTT法）将人膀胱癌T-

5、24细胞以每孔5×103个细胞数接种于96孔培养板中，每孔培养液200μL。分组为：对照组、药物组（使Art终浓度为10、40、60μmol/L）；待细胞贴壁生长后，药物组细胞分别加入相应浓度的Art，对照组中加入等体积培养液，每组均设3个复孔，置于370C，5%CO2条件下培养箱中分别孵育24、48、72h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，再次置于细胞培养箱中继续培养4h后终止培养，弃掉培养液，每孔加入150μlDMSO，充分振荡10min，使结晶充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定

6、各孔光密度值OD490，实验重复3次。按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（对照组D490值-用药组D490值）/对照组D490值×100%。　　1.2.3划痕实验检测Art对T-24迁移能力的影响将T-24细胞接种于6孔细胞培养板中，使细胞密度为2×105个细胞/孔，分组为：对照组、Art组（40、60μmol/L），将细胞进行培养24h后，用10μL枪头于细胞层中划一直线，形成宽度均匀一致的细胞伤口模型，每孔划3条伤痕，用PBS洗掉悬浮的细胞后，再加入相应浓度药物，而对照组中加入等体积培养液，分

7、别在培育0、24、48h时，于光学显微镜（×100）下观察并测量划痕的宽度，分别计算3条平行划痕的平均距离（每条划痕各取3个固定位置计算距离），实验重复3次。细胞迁移能力以迁移率表示：迁移率=（原划痕宽度-现划痕宽度）/原划痕宽度。　　1.2.4流式细胞仪（FCM）测定Art对T-24细胞周期以及凋亡的影响取处于数生长期的人膀胱癌T-24细胞，消化传代后，重新接种于培养瓶，使其密度为5×105/ml；分组为：对照组、药物组（使Art终浓度为10、40、60μmol/L）；待细胞贴壁后，药物组细胞分别加入相应

8、浓度的Art，对照组加入等体积培养液，培养48h后收集细胞，用70%冷乙醇分散固定细胞，4℃过夜。取固定好的细胞加PBS洗涤一次，离心弃上清，然后加入50μg/ml的RNase1ml置于37℃水浴锅中30min，离心去上清，加入60μg/ml的PI1ml，避光孵育30min，经尼龙网过滤，上机进行检测，用流式细胞仪进行细胞周期以及凋亡分析。　　1.3统计学分析应用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析，数据用x