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1、华夏医学第13卷第1期2000年2月Vol.13No.1Feb.2000ACTAMEDICINAESINICAEB病毒裂解期DNA复制的研究概况曾越(法国里昂第一大学免疫病毒分子生物学实验室)Epstein2Barr病毒(EB病毒)属人类疱疹病毒,是传染性单核细胞增多症,Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌的主要诱发因素,其中鼻咽癌在我国南方,特别是广东和广西等省(区)发病率很高(10～30ƒ100000),占癌症发病率首位。此外,EB病毒与T淋巴细胞瘤,口腔腺体肿瘤,胸腺瘤,器官移植后淋巴瘤等肿瘤的病因关系在国际上也有报道1,2。EB病毒进入宿主细胞后,处于潜伏期,病毒基因组持续存在于细胞
2、内,只有少量病毒蛋白表达。超早期蛋白的出现标志着病毒周期进入裂解期,其中包括早期,DNA复制期和晚期。早期病毒蛋白主要用于DNA复制,而晚期蛋白是一些壳蛋白和膜蛋白,用以包装复制完成的DNA,形成病毒颗粒。一个完整的病毒周期如图1所示。病毒在裂解期的DNA复制是它在细胞里繁殖的重要阶段,因此对这个过程的研究是了解病毒作用机理和抵抗疾病的重要一环。2EB病毒裂解期DNA复制的参与蛋白1992年,Fixman等6研究了EB病毒基因组不同片段对含有Orilyt质粒复制的影响,实验证明有6种蛋白对病毒的DNA复制是必不可少的,它们分别是:ZEBRA蛋白,DNA多聚酶及其辅助蛋白EA2D,解链
3、酶和引物酶的复合体,还有主要DNA结合蛋白P135。ZEBRA蛋白:这是一个超早期蛋白,由245个氨基酸组成。它不仅是一个转录活化因子7,可以激活一些早期蛋白的转录,而且可以识别Orilyt,对病毒DNA复制起着重要作用。转录因子在DNA复制过程中发挥作用的例子屡见不鲜,如AP18,VP169和Ga1410,它们的作用机理可以大致分为:一方面通过与DNA特殊序列相结合而改变基因组复杂的空间结构,使其他DNA复制蛋白容易进入复制区;另外转录因子可以通过与复制蛋白的结合,把它们装置在复制起始位点上,共同完成DNA复制的使命。解链酶与引物酶的复合物:它由3个蛋白结合而成,其中包括解链酶,引
4、物合成酶和它们的结合蛋白6。目前国际上对这个蛋白复合物的研究有限,但对单纯疱疹病毒(HS病毒)的同源复合蛋白了解较多,由此可以推测其功能:使两条母链DNA分离,合成RNA引物,供DNA多聚酶合成DNA。第三个结合蛋白的功能可能是与另外两个酶结合,形成复合物,并11促进这两个酶的活性。Gao等的实验证明只有三个蛋白同时存在,这个复合物才会出现在细胞核中,缺少其中任何一个,另外两个蛋白都只分布在细胞浆里,不能参与DNA复制。图1EB病毒在宿主细胞里的繁殖周期1EB病毒裂解期DNA复制的起始位点在1988年,Hammerschmidt和Sugden3通过对带有EB病毒基因组不同片段的质粒复
5、制能力的分析,确定病毒基因组上两段相同的序列为裂解期DNA复制起始位点,它们被命名为Orilyt。这两个Orilyt位点之中任何一个都可以使DNA进行复制,至于病毒在进化过程中为什么会保留两段功能相同的Orilyt,有可能它们在不同的宿主细胞内,或在细胞周期的不同阶段所起的作用不同:也有可能是它们可以交替使用,为确保病毒在被选择的过程中占据优势。Orilyt的中心部分约1,4kb,由两个带有重复序列的‘基本区’和一段‘辅助区’构成。‘基本区’的碱基空间序列呈螺旋状,其中一个碱基的改变可以使整个带有Orilyt的质粒失去DNA复制功能4,而‘辅助区’虽非缺之不可,但它的存在可以大大提高
6、质粒的复制。此外,Orilyt上有七个ZRE位点,这些位点可以被病毒超早期蛋白ZEBRA识别,其中四个位点是DNA复制所必不可少的5。DNA多聚酶及其辅助蛋白EA2D:DNA多聚酶为110kd。它与带有RNA引物的DNA的亲和力大于单链DNA或RNA12,由此可以推断DNA多聚酶可以从RNA引物起始,对母链DNA模板进行复制,按照碱基互补的原则,合成子链DNA。另外DNA多聚酶有反向(3’到5’)外切DNA的特性13,可以令其切除在合成DNA过程中末端出现错误的碱基,保证复制的正确率。EA2D蛋白是DNA多聚酶的结合蛋白,约50kd。细胞体外实验证明它可以大量提高DNA多聚酶的两种特
7、性:从5’到3’合成DNA,和从3’到5’外切DNA14,15。EA2D的作用机理可能在于增强DNA多聚酶与DNA模板相结合的稳定性,防止DNA多聚酶脱离DNA,因而终止子链DNA的合成。主要DNA结合蛋白P135:它由1128个氨基酸组成。这是一个DNA结合蛋白,尤其与单链DNA亲和力较高16。它在DNA复制过程中所起的作用至关重要:在带有部分缺失的EB病毒基因组的Raji细胞株里,病毒在活化剂的诱导下进入裂解期的早期,但不能进行DNA复制。而当其中一个
