应用pcr-sscp检测先天性软骨发育不全患者

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1、应用PCR-SSCP检测先天性软骨发育不全患者【摘要】目的应用PCR-Single-Strondedconformationpolymorphism（PCR-SSCP）技术对先天性软骨发育不全患者进行检测。方法对3例疑似先天性软骨发育不全患者、1例确诊患者应用基因组DNA聚合酶链反应-单链构象多态技术进行检测。结果3例疑似患者中2例出现和确诊患者同样的异常泳带，此泳带在正常人中不存在。结论PCR-SSCP技术可实现对先天性软骨发育不全患者的检测。【关键词】先天性软骨发育不全；聚合酶链反应；单链构象多态DetectionofachondroplasiabyPCR-SSCPZHAOXin

2、,WUYu,ZHUXiao-he.【Abstract】ObjectiveTodetectionachondroplasiabyPCR-SSCP.MethodsThegenomicDNAfrom1clinicallydiagnosedachondroplasiapatientand3suspiciouspatientswithachondroplasiawasdiagnosedbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-SSCP).Results2in3suspiciouspatientswit

3、hachondroplasiahavethesameabnormalband,whichdoesnotexistinnormal8people.ConclusionPCR-SSCPcanbeusedthediagnosisofachondroplasia.【Keywords】Achondroplasia;Polymerasechainreaction;Single-Strondedconformationpolymorphism先天性软骨发育不全(achondroplasia，ACH)是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，在活产婴儿中的发病率为1/15000～1/77000，为常染色体显

4、性遗传，无家族史，约80%患者为散发型。表现为短肢型身材矮小，头大，前额和顶骨圆凸，鼻梁下陷，腰椎前凸，弓形腿，“V”字形手等。至今已发现ACH的3种基因突变，均位于FGFR3跨膜区，多数为1138位核苷酸的G→A转换，少数为G→C颠换，还有个别为1123位核苷酸的G→T颠换。1对象与方法1．1对象沈阳市中国医科大学第二附属医院儿科遗传门诊的3例疑似ACH患者、1例确诊患者和1名无ACH家族史的正常人。1．2方法1．2．1DNA模板的制备取受试者静脉血5ml，加EDTA抗凝剂0．5ml混匀，用常规方法，血标本经蛋白酶K处理，苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀物溶于缓冲液(10mmol

5、/LTris-HCl，pH7．4；1mmol/L8EDTA，pH8．0)。所得DNA用紫外分光光度计检测吸光度，A260/A280约为1．8。1．2．2基因片段PCR扩增引物合成：上游引物和下游参照文献[1]，由上海博亚公司合成，引物序列为：5′-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3′和5′-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3′PCR反应体系：每25μl反应体系中，含10×PCR缓冲液�2．5μl�，dNTP2μl，上游和下游引物各2．5μl，TaqDNA聚合酶0．2μl，去离子水10．3μl，模板DNA5μl。反应程序：94℃变性8min后，按94℃40s、65℃3

6、0s、72℃40s循环30次，最后72℃延伸7min结束反应。1．2．3PCR扩增产物鉴定取PCR扩增产物10μl，指示剂溴酚蓝1μl混匀后加入2%琼脂糖凝胶孔中，电泳缓冲液1×TDE，80V电泳30min，溴化乙锭染色后紫外灯下观察。检查有无扩增出目的条带及扩增出的目的条带是否理想，如不理想或有非特异性条带存在，则重新扩增直至得到较理想的扩增产物。1．2．4单链构象多态性分析取PCR产物5μl，加入等体积的变性液(95%甲酰胺，20mmol/LEDTA，0．05%二甲苯蓝，0．05%溴酚蓝)混匀，97℃变性10min，使PCR产物解为单链，立即将解链产物置冰浴中骤冷5min。将此变

7、性产物加入12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49∶1)中，室温100V恒压垂直电泳2008min。待溴酚蓝走至胶底，二甲苯蓝走至约2/3胶长时，停止电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下检测电泳条带并照相。2结果2．1PCR扩增产物鉴定结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，观察证实每一标本都扩增出来。2．2单链构象多态性分析结果样品DNA经SSCP分析，3例疑似ACH患者中发现P1、P2存在和阳性对照相同的单链泳动变位，带形一致，说明存在相同的DNA碱基变异。另外1例疑似患者