实时荧光定量pcr技术在植物检疫中应用的研究进展

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1、实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展摘要：实时荧光定量ｐｃｒ技术是在ｐｃｒ反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个ｐｃｒ反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来，实时荧光定量ｐｃｒ技术在植物检疫研究上不断深入，大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量ｐｃｒ技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。关键词：实时荧光定量ｐｃｒ技术；植物检疫；植物病害ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆａｐｐｌｉ

2、ｃａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌｔｉｍｅfluorescentｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅｈｕａｎｇｈａｉ－ｑｕａｎ（ｂｅｉｌｕｎｅｎｔｒｙ－ｅｘｉｔｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｒａｎｔｉｎｅｂｕｒｅａｕ，ｎｉｎｇｂｏ３１５８００，ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｆｑ－ｐｃｒｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆａｄｄｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓｉｎｔｈｅｐｃｒｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｃｃ

3、ｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｉｇｎａｌ，ｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｐｃｒ）ｐｒｏｃｅｓｓcouldbemonitoredｉｎｏｒｄｅｒｔｏquantitativelyａｎａｌｙｚｅｕｎｋｎｏｗｎｔｅｍｐｌａｔｅｂｙｍｅａｎｓｏｆｍａｋｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ．ｆｑ－ｐｃｒｈａｓｇｏｏｄｆｅａｔｕｒｅｓｓｕｃｈａｓｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙｏｆｏｐｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ａｎｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｔｃ．ｉｎｒｅｃｅ

4、ｎｔｙｅａｒｓ，applicationofｆｑ－ｐｃｒｉｎｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅwasstudiedａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅdetectingｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｌｅｖｅｌｏｆｐｌａｎｔｅｐｉｄｅｍｉｃ．tｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｓｅｐｉｄｅｍｉｃｃａｕｓｅｄｂｙｆｕｎｇｉ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｎｅｍａｔｏｄｅｓwascomprehensivelydescribed．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅ

5、ａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒ；ｐｌａｎｔｑｕａｒａｎｔｉｎｅ；ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ实时荧光定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｃｒ，ｆｑ－ｐｃｒ）技术是２０世纪９０年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。最早是由ｈｉｇｕｃｈｉ等［１］于１９９２年提出来的，１９９６年由美国ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出。与普通ｐｃｒ相比，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。过去实时荧光定量ｐｃｒ技术主要应用在医学

6、诊断、新型农业、基础研究等领域［２］，而在植物检疫中的应用相对较少［３］，随着分子生物学的不断发展，特别是在检疫检验系统，实时荧光定量ｐｃｒ技术已经被广泛用来检测植物病害，有效地遏制了国外有害生物的入侵，保证了生物入境安全。１实时荧光定量ｐｃｒ技术原理实时荧光定量ｐｃｒ技术是指在ｐｃｒ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个ｐｃｒ技术进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量ｐｃｒ技术中有一个很重要的概念，即ｃｔ值。ｃ代表循环（ｃｙｃｌｅ），ｔ代表阈值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）。ｃｔ值是指每个反应

7、管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ｃｔ值越小。因此，要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再利用分析软件获得未知样品的ｃｔ值，便能根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数［４］。２实时荧光定量ｐｃｒ技术检测方法该检测方法主要分为两大类：第一类是使用特异的双链ｄｎａ（ｄｓｄｎａ）结合染料，常用的有ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ和ｌｃｇｒｅｅｎ；第二类则是应用荧光标记探针，如ｔａｑｍａｎ探针、分子信标等，是建立在荧光共振能量转移原理（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ

8、ｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ｆｒｅｔ）［５］上的。２．１ｓｙｂｒｇｒｅｅｎｉ荧光染料检测技术ｓｙｂｒｇｒｅｅｎｉ是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于ｄｎａ双链结构的小沟中，非特异地与ｄｓｄｎａ分子结合，是应用最广泛的非探针类化学检测物。当