水稻不同品种再生及转基因频率分析

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1、水稻不同品种再生及转基因频率分析1文献综述1.1转基因方法1.1.1DNA直接转化法电激法又称电融合法，也是以原生质体为受体的转化方法。转化效率比PEG法高，原理是利用短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜形成可逆的瞬间通道，使DNA进入细胞；此法最初应用于动物细胞，现已广泛应用于各种单子叶植物和双子叶植物原生质体的转化[2]，具有简单方便、对细胞低毒性以及转化率高等优点。但该法也存在不足之处，如将DNA与细胞直接共同培养并电击时，直接裸露的DNA受到电击、酶切的物理和化学损伤较大，影响转化效率且周期太长，不适合用于大规模的研究

2、，并且这种方法对由于目的基因沉默引起胚胎和发育早期过程中死亡的转化不会有效。基因枪法发展于20世纪80年代末，原理是把外源DNA包埋于微小的金粒或轉粒表面，再通过高压将微粒高速地射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，与植物染色体上的DNA得以整合并表达，从而实现基因的转化[6]。自1989年首先用基因枪转化玉米获得转基因植株以来，在水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦等重要禾谷类作物中相继获得成功，具有操作简便，重复性好，受体材料广泛等优点，但也存在成本昂贵，转化频率较低的缺点。1.1.2农杆菌介导转化法1.1.2.1

3、农杆菌转化法在水稻应用中的研究进展农杆菌介导转化法是将外源基因插入农杆菌的质粒上，由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中的方法，是目前应用最广泛的转基因方法。具体过程包括：受体系统的建立、转化载体的构建和目的基因的转化三个方面。1994年Hiei[9嗜利用超双元载体和在共培养过程中加入乙酸丁香S同等方法大大提高了水稻的转基因频率，此后更多的农杆菌介导的转化系统被逐步建立，目前在校稻和爪唾稻中，农杆菌介导的转化已成为一个极为有效的体系，而这些水稻品种良好的离体组织培养性能也是其基因转化成功的关键因素之一近年来，随着转化

4、技术的发展，农杆菌介导转化籼稻成功的例子也相继被报道根癌农杆菌Ti质粒转化系统是应用最广、机理最清楚、方法最成熟的转化系统之一。利用土壤农杆菌转化水稻，其再生频率可高达10%-30%。该转化系统具有成功率高，遗传稳定性好，载体可容纳大片段异源DNA等优点。转化受体的选择：在水稻的遗传转化中，转化受体通常于幼胚、幼穗和成熟胚的生长旺盛的胚性愈伤组织[18]。但是不同基因型的水稻其转化频率的高低存有差异，Chan等研究发现一般粳稻比軸稻的转化频率高，这可能与籼稻愈伤组织形成、继代和再生植株困难等因素有关，有相关研究报道采用幼胚

5、的愈伤组织进行根癌农杆菌转化时，其转化频率均高于于成熟胚的愈伤组织的转化频率（平均高出1-2倍）。但是水稻幼胚在取材时受到季节性的限制，且易被污染，而水稻成熟胚愈伤组织虽然转化频率相对于幼胚来说较低，但不易被污染且不受季节影响，可长其存放。此外，报道表明通过选择胚性愈伤组织在适当的培养基上继代培养可以保持它们的胚性。菌株和质粒的选择：一般来说广泛使用的农杆菌菌株主要包括EHA105、LBA4404、A281、A656、EHA101、AGL1等[24]，其中以EHA105应用最广泛。用于转基因的质粒需要携带选择标记、外源基因

6、、启动子等。常用的选择标记有：潮霉素碟酸转移酶基因，新霉素碟酸转移酶基因基因）和除草劍抗性基因基因）。2不同水稻品种组织培养能力的考察2.1材料与方法2.1.1实验材料本研究共选取23份水稻品种进行考察，包括5份粳稻材料（P09、RUKE1085、R128、E667)和16份轴稻材料（R198、R102、桂99、R974、粵泰B、R838、R998、R9I13、Q611、华占、527、密阳46、茂恢86、R8006、中浙B、明恢82、R608、成恢727)，有关水稻品种的详细介绍见附表1。由于R198和R102这两个材料，

7、成熟胚太少，没能够获得足够愈伤，因而没有对它们的组培再生数据进行统计。其它各水稻测试品种在经过NBm愈伤诱导培养基上15天的培养后，尽管所有品种愈伤诱导率均大于25%，但是不同基因型之间，水稻的愈伤诱导率仍存在较大差异，其中粳稻品种中R128的诱导率最高，达到70%以上，E1085和E667愈伤诱导率也接近70%，P09和R111的愈伤诱导率稍低，约为50%;轴稻品种中Q611，华占，R8006，中浙B和成恢727的愈伤诱导率较高，接近60%，R838最低，约30%，其它大部分籼稻测试品种的愈伤诱导率都集中在30%-60%

8、之间（图2.1)。研究中发现各水稻品种在愈伤诱导率这一考察指标上均取得较好的重复性，且部分粳稻品种愈伤诱导率相对高于轴稻。但同时也观察到，多数軸稻材料愈伤出现较早，多在培养6天以内出现，而粳稻开始诱导出愈伤的时间均在培养一周以后，相对较晚。3.实验结果..........193.1材料和方法......