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时间:2018-07-09
《小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态cd31、cd34、组织蛋白酶d表达意义》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态CD31、CD34、组织蛋白酶D表达意义【摘要】目的动态观察CD31、CD34、组织蛋白酶D在黑色素移植瘤血管生成拟态形成(VM)中的表达。方法制作小鼠黑色素移植瘤动物模型,成瘤后每天随机抽取1只小鼠处死,12d共获得肿瘤样本114例;行HE染色、CD31、CD34、组织蛋白酶D免疫组化染色。结果移植瘤早期存在VM,晚期被内皮依赖性血管替代;VM周围肿瘤细胞中CD31、CD34阳性百分率高于远离VM区域的阳性百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性百
2、分率之间存在差别;VM周围肿瘤细胞组织蛋白酶D阳性百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性百分率;VM密度与VM周围肿瘤细胞CD31、CD34阳性百分率相关;内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率相关。结论移植瘤中VM是暂时性血液供应方式;组织蛋白酶D、CD31、CD34均与黑色素移植瘤VM形成有关。【关键词】血管生成拟态;肿瘤血管生成;细胞黏附分子;恶性黑色素瘤;组织蛋白酶D 血管生成拟态形态(VM)是肿瘤细胞变形并相互黏附形成的暂时血液供应模式,与内皮血管共存并密切相关,CD31、CD34是
3、血管内皮标记物,均与血管新生有关,而与VM的关系未见报道;组织蛋白酶D是肿瘤细胞浸润间质重要的蛋白酶,与肿瘤细胞外基质重塑相关,本实验通过对肿瘤VM中上述各种指标表达的动态变化的研究,探讨其在VM形成中的作用。 1材料与方法 1.1实验动物与方法C57小鼠购自北京军事医学科学院动物室,6~8周龄,共20只,雌雄各半,体重25~30g,编号后洁净实验室饲养。B16细胞株复苏,1640细胞培养基培养6d,0.2%胰酶消化,调整细胞密度达到1×107/ml。75%乙醇消毒小鼠蹊部,每只小鼠皮下注射0.2ml细胞悬液,多处
4、种植。10d后成瘤,根据随机数字表每天处死1只小鼠,共12d。获取所有肿瘤样本114个。10%甲醛固定,常规石蜡包埋。 1.2免疫组织化学染色 1.2.1试剂鼠抗小鼠CD31、CD34、组织蛋白酶D单克隆抗体,购自福建迈新试剂公司,0.1ml包装,工作浓度1∶50;二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001,购自北京中山试剂公司。 1.2.2免疫组化主要步骤二甲苯脱蜡、梯度乙醇至水,3%过氧化氢灭活内源性过氧化酶,PBS缓冲液振洗,抗原微波热修复,山羊血清封闭、一抗4℃过夜,二抗、三抗各孵育1h,DAB显色10
5、~15min,复染核脱水透明,中性树胶封固。 1.3计数方法 1.3.1区域划分中央区与外周区的划分:避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成3等份,内1/3区域为中央区,外1/3为外周区。VM周围与远离VM、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分:以VM、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为VM、内皮依赖性血管周围;距离上述视野1个高倍视野的肿瘤细胞即为远离VM和内皮依赖性血管。 1.3.2计数低倍镜下找到典型区域,在高倍镜下(×400)连续计数10个高倍视野内的VM、内皮依赖性血管,其均值即为
6、VM密度、内皮依赖性血管密度;计数VM周围、内皮依赖性血管周围、远离VM、远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性细胞数。 1.4统计学处理应用SPSS10.0统计软件,两样本之间作Mann周围各指标的表达与VM密度、微血管密度之间作直线回归相关分析。 2结果 2.1常规形态学观察肿瘤直径4mm~1.5cm,血管丰富,浸润生长,周界不清,部分区域散在出血坏死。镜下可见肿瘤细胞周围形成没有内皮细胞衬覆的不规则腔隙,内可见红细胞,即VM,共26例。中央区VM较多见,外周区VM较少。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区。在移
7、植瘤成瘤的第1~8天可见到典型的VM样结构,至第9~12天被内皮依赖性血管所替代。中央区的VM密度在移植瘤形成后的第1~3天呈递增趋势,第4~8天呈递减趋势。肿瘤外周区的VM密度在第1~4天呈现递增趋势,在第5~8天呈现递减趋势。从空间上对比两个区域内的血管生成拟态密度显示:在第1~6天肿瘤中央区的密度高于外周区的密度,在第7~8天肿瘤外周区的密度高于中央区的密度。内皮依赖性血管密度在肿瘤的中央区和外周区均呈现递减趋势。空间上对比两个区域内的内皮依赖性血管密度发现:在第1~7天肿瘤中央区的密度高于外周区密度,在第8~1
8、2天肿瘤两个区域内密度差别不明显。 2.2各种指标在肿瘤不同区域的表达变化规律 2.2.1CD31在肿瘤不同区域的表达肿瘤细胞表达CD31抗原,且围成VM的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原,VM周围的肿瘤细胞高表达CD31抗原。统计学分析显示:VM周围的肿瘤细胞表达CD31的阳性率高于远离VM肿瘤细胞,内皮依赖性血管周围肿
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