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1、tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体构建第14卷第5期2006年lO月中国医学工程ChinaMedicalEngineeringVo1.14No.5Oct.20o6文章编号:1672—2019(2006)05—0449—03tRNA-CTE复合核酶真核表达载体构建木蒋永芳,龚国忠,许允,何艳,刘波(中南大学湘雅二医院肝病研究中心,湖南长沙410011)?论着?摘要:目的构建tP,_NA'~-CTE复合核酶真核表达载体,为进一步研究打下基础.方法用RT—PCR法扩增CTEcDNA;合成含tR_NA,~启动子和HCV5-NCR区195位的核酶以覆内切酶Kpn
2、I和EcoRV序列,通过退火连接到pPUR质粒的BamHl和EcoRI的酶切住点之间,构建质粒pPHCV—Rz;用KpnI和EcoRV双酶切后,将CTEeDNA定向插入表达栽体pPHCV-R.z多克隆位点中,构建成重组表达质粒,并用酶切分析和序列测定进行了鉴定.结果酶切鉴定和测序证实tR_NA'~启动子和HCV5-NCR区195住的核酶基因以覆CTEcDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK.结论tRNA~一CTE复合核酶真核表达栽体的成功构建,为开展利用tR_NA'~-CTE复合核酶切割HCVR.NA的研究奠定了基础.关键词:核酶;D型逆转录病毒胞浆转运信号序列
3、CTE;表迭栽体中图分类号:Q781文献标识码:AConstructionofeukaryoticvectoroftRNA,-CTEhybridribozymeJIANGYong—fang,GONGGuo-zhong,XUYan,HEYan,LIUBo(CenterforLiverDisease,SecondXiangyaHospital,CenteralSouthUniversity,Changsha,Hunan410011,P.R.China)Abstract[Objective】Toconstructaneukaryoticexpressionvector
4、oftRNA试一CTEcombinedribozymeasabasisforfurtherstudy.【Methods】TheCTEcDNAwassyr~thesizedbyRT-PCRwiththespecificprimers.Theoligonu—cleotidelinkersencodingthesequenceofthetRNApromoterandKpnIandEcoRVandribozymetargeting195siteofHCVNCRwereannealedandligatedintotheBamHI/EcoRIsiteofpPUR,wasde
5、signatedpPHCV-Rz.M-terrestrictionendonucleaseKpnIandEcoRVdoubledigestedit,thetargetfragmentwassubclonedintoeukaryoticvectorpPHCV—Rztoconstructeukaryoticexpressionrecombinant.Theexactitudeofrecombinevectorwasidentifiedbydigestionandsequencinganalysis.【Results】Therecombinantplasmidwith
6、thetRNA-CTEhybridrebozymewasconstructedsuccessfullybysequencinganalysisandbydigestionidentification.【Conclusions】WeconstructtheeukaryonexpressionvectorcontainingthetRNA~a-CTEhybridribozymegenesuccessfullywhichisthefoundationforfurtherstudy.Keywords:constitutivetransportelement;fibozy
7、me;expressionvector丙型肝炎病毒(HCV)是～正链RNA病毒,通过核酶技术抑制HCV的复制和表达是近年来研究的热点.然而核酶的作用受很多因素的影响,包括镁离子的浓度,细胞内核酶的稳定性,核酶在细胞内的分布以及靶RNA的空间构型阻碍核酶与之结合等,其中靶RNA的空间构型成为目前影响普通核酶在细胞内的切割效率最为关键和最难控制的因素.为此我们设计了针对HCV5端非编码区(5-NCR)结合D型逆转录病毒胞浆转运信号序列CTE(COil—stitutivetransportelement)的复合核酶,期望能一定程度上解决靶RNA的空间构型阻碍核酶与之结
8、合的矛盾,并构建复合核酶
