人mxa转基因克隆猪之制作及初步分析

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1、人MxA转基因克隆猪之制作及初步分析第一篇文献综述第1章MxA抗病毒蛋白的研究进展当病毒侵染宿主时，动物自身的免疫系统会迅速应答以抵抗抗原的复制。其中由I型干扰素IFNα/β诱导产生的Mx蛋白是抵抗病毒感染过程中最有意义的决定因子之一。这种具有GTP酶活性的抗毒蛋白广泛存在于脊椎动物，属于含有亮氨酸锌指结构的高度保守的蛋白。MxA蛋白具有广谱的抗病毒作用，对多种RNA病毒和一些其它病毒均有明显的抑制作用，具有极大的临床应用价值和广阔的研究前景。1.1Mx蛋白的发现Horisberger等证实这种抗毒作用只受IFNα/β调节，而非

2、IFNγ调节，继而通过2D电泳分析了IFNα/β诱导后的细胞，发现多出一条大小为75kd的多肽，于是将这种多肽统一命名为Mx蛋白[3]。后来又发现，诱导后得到的多肽为混合物，可分为两种MxI和MxII蛋白，其中MxII没有抗毒活性[4]。人的Mx基因也能表达与小鼠类似的同源MxA和MxB两种蛋白，MxB蛋白无抗病毒活性[5-6]。经深入研究，人们现在证明活化的Mx蛋白具有GTP酶活性，是动力蛋白超家族中的一员[7]。固有的GTP酶活性与的抗病毒作用的发挥密切相关，能够使Mx蛋白多聚体与病毒蛋白形成复合物并具有水解作用[8]。1.2MxA蛋

3、白的结构人体内，Mx蛋白由第21号染色体编码，经I型IFN诱导通过JAK/STAT路径可产生78kD大小的MxA和MxB蛋白，人类的MxA基因也被称作干扰素诱导蛋白p78（IF178）这两种蛋白都布于胞质中[9]。MxB蛋白目前研究未发现有抗病毒活性，而MxA蛋白具有广谱的抗病毒作用，是继寡腺苷酸合成酶(OAS)和蛋白激酶PKR之后发现的又一种抗病毒蛋白，与前两者同属IFN下游基因，是构成天然免疫屏障的强力抗毒因子。1.2.1MxA蛋白的结构活化的Mx蛋白有较强的GTP水解特性，属于IFN-诱导的大GTP酶，与细胞内病原的控制有关[10-11]。包括有免疫相关P47GTP

4、酶和鸟苷酸结合蛋白(GBPs)都可以抑制入侵的细菌和原虫的生长。动力蛋白样GTP酶可介导包括膜重塑在内的许多基本的细胞进程，由于序列相似程度和生化及结构性质，Mx蛋白的功能与许多GTP酶超家族的其他成员极为相似[4]。MxA蛋白分子量较大约为78kd，表达过程中能够进行自我装配。MxA蛋白与多数动力蛋白样GTP酶家族中的其它成员有在结构上有很高的相似性，在GTP效应区约有30-40%的序列与其它成员相同。MxA含有一个约由300个氨基酸组成氨基末端GTP酶结构域，一个中间结构域(MD)约含有150个氨基酸，和一个羧末端GTP酶效应结构域(GED)约含有100个氨基酸[10

5、,12]。高度保守的GTP结合基序存在于氨基末端，而MD结构域及GED末端区域在蛋白的相互作用中起着重要作用，能产生两性分子双螺旋作用的2个亮氨酸锌指结构亦在此区。与动力蛋白类似，人MxA也为四聚体，与鸟苷酸亲和性较低，同时具有依赖于浓度的寡聚能力和应急装配GTP酶的活性[11,13]。尽管MxA蛋白属于大分子GTP酶的动力蛋白超家族，但它与标准的GTP酶动力蛋白并不完全相同：MxA蛋白不含有富含SH3结合位点的精氨酸-脯氨酸结构；MxA也没有典型动力蛋白膜结合域所含有的同源结构[10,14]。基于电镜下MxA和动力蛋白寡聚物外表的相似性和介导寡聚化的氨基酸残基序列的相似

6、性，目前研究已确定MxA存在更高级的网状球形结构，该结构由可以折叠为四个螺旋束的MD和GED的N末端组成，有可能是发挥GTP酶水解和抗病毒功能的基本结构单元[8,15]。在此基础上，德国科学家Ottohaller[2,4,8,10]等提出了MxA的晶体结构模型，推测三级结构可能由一个球状的GTP结合域和由多个螺旋结构组成的向外延伸的羧端效应域组成。MxA蛋白的自我装配及与识别、结合相应靶结构的的功能由至少三个效应结构来完成，分别是氨基末端自装配序列（SAS）、中央活性区（CID）和前述的亮氨酸锌指结构（LZ）。通过点突变LZ近端第612的碱基会导致MxA突变体丧失自我寡聚

7、合与GTP酶水解的能力[7]，说明作为效应区的LZ与GTP酶功能的发挥有关。第二篇研究内容第1章MxA真核表达载体的构建干扰素系统是在病毒感染后立即启动的宿主细胞防御系统。干扰素发挥其抗病毒活性要激活至少三个主要蛋白，OAS、PKR和Mx蛋白。Mx蛋白是由IFN诱导的蛋白，已从多种脊椎动物包括人和小鼠中成功分离，并且在IFN诱导的抗病毒活动中发挥重要的作用。人有两种Mx蛋白，MxA和MxB。人MxA蛋白主要集中在胞质中，可干扰流感病毒，杆状病毒和汉坦病毒的复制。人MxB蛋白与MxA蛋白在序列上有一定相关性，并在细胞核和细胞质中